靶向白血病生物标志物TDT的新型荧光探针：原理、构建与应用

本研究由Mathijs J. Pals与Willem A. Velema*（通讯作者）合作完成，工作单位均为荷兰拉德堡德大学的分子与材料研究所。该研究成果以论文形式发表于《Angewandte Chemie International Edition》期刊，于2023年在线发表（Angew. Chem. Int. Ed. 2023, 62, e202302796）。

学术背景与研究目的 本研究属于化学生物学、分析化学与分子诊断学的交叉领域，核心在于开发一种用于实时、高选择性检测特定酶活性的新型分子工具。研究聚焦的靶点是末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase, TDT）。TDT是一种不依赖模板的DNA聚合酶，在人体适应性免疫系统中扮演关键角色，负责在B细胞和T细胞中通过随机添加核苷酸来增加T细胞抗原受体和免疫球蛋白的多样性。然而，TDT的异常高表达与多种白血病（如急性髓系白血病AML、急性淋巴细胞白血病ALL和慢性粒细胞白血病CML）密切相关，因此它被视为重要的白血病生物标志物和潜在的治疗靶点。然而，现有的TDT检测方法（如免疫学测定或凝胶电泳）通常耗时、操作复杂、成本高且无法实时定量酶活性。尽管已有一些基于发光、ATP偶联或电化学原理的新方法被开发，但它们或依赖于检测反应产物而非直接监测酶活，或存在选择性不佳、需要特殊环境或设备等局限性。因此，开发一种能够直接、实时、高选择性且操作简便的TDT活性检测方法，对于白血病的基础研究、临床诊断和药物筛选具有重要价值。本研究旨在构建并验证一种基于荧光共振能量转移（FRET）淬灭机制和尺寸扩展核苷酸的荧光探针（命名为XA探针1），用于直接、实时、高选择性地报告TDT的酶活性，并探索其在细胞环境检测和高通量抑制剂筛选中的应用潜力。

详细研究流程与方法 本研究包含四个主要部分：探针的设计与合成、体外酶活性检测、选择性验证以及在复杂生物样本与药物筛选中的应用。

第一部分：XA探针1的设计、合成与光谱表征。 研究团队设计探针的核心策略是模拟天然核苷酸三磷酸（dNTP）底物，使其能被TDT酶识别并参与DNA合成反应。为实现对TDT的高选择性（避免被其他高保真DNA聚合酶识别），他们采用了尺寸扩展的DNA（xDNA）碱基作为荧光团，特别是具有高亮度和大摩尔消光系数的尺寸扩展脱氧腺苷（dxA）。探针的淬灭部分采用了常见的Dabsyl淬灭基团，并通过一个四磷酸链将荧光团（dxA）与淬灭基团（Dabsyl）连接起来。这种设计使得完整的探针因FRET效应而荧光微弱。当TDT利用该探针作为底物进行DNA合成时，探针分子的α-磷酸键会发生断裂，导致荧光团与淬灭基团分离，从而释放出强烈的荧光信号。探针的合成路线始于Dabsyl氯与乙醇胺反应生成中间体3，随后经过磷酸化等步骤得到带有三磷酸基团的Dabsyl部分（化合物5）。另一方面，尺寸扩展核苷（化合物6）经磷酸化得到dxAMP（化合物7）。最后，通过化学偶联将化合物5与化合物7连接，得到最终的目标探针XA探针1。光谱表征显示，游离的dxA核苷在371 nm和388 nm有强发射峰，而完整的XA探针1在相同浓度（5 μM）下的荧光强度降低了63倍，证实了有效的FRET淬灭效果，为后续实时监测酶活性提供了基础。

第二部分：利用探针监测TDT的引物延伸与从头合成活性。 首先，通过凝胶电泳和质谱分析验证了XA探针1能被TDT识别并作为底物掺入到DNA链中。实验使用一个FAM标记的18-nt引物，在TDT存在下，观察到引物被延长了1到2个核苷酸，证实了探针的底物功能。随后，通过实时荧光测量评估了探针对TDT活性的定量能力。将不同浓度的TDT与XA探针1及非标记引物在37°C孵育，持续监测393 nm处的荧光强度。结果显示，荧光信号随孵育时间稳步增长，且增长速率和最终强度与TDT浓度呈正相关，证明了探针可用于体外实时定量TDT活性。有趣的是，研究还探索了TDT独有的“从头合成”能力（即无需引物，仅以核苷酸为底物起始DNA合成）。在仅有XA探针1和TDT的体系中，荧光信号同样出现增长，且信号增强幅度比引物延伸实验更强。作者推测这可能是因为没有引物占据引物结合位点时，TDT的活性位点更能容纳庞大的尺寸扩展碱基。通过添加不同竞争物（ddATP、dATP和dA）的实验进一步证实了该荧光信号确实来源于TDT催化的从头合成反应。

第三部分：探针的选择性验证。 为确保探针在复杂生物环境中应用的可靠性，研究团队测试了XA探针1对TDT的选择性。他们将探针与一系列细菌及人类的高保真DNA聚合酶（包括Pfu、Phi29、KF、Bsm、人Pol α和Pol β）、两种磷酸酶（LPP和PLAP）以及一种ATP酶共同孵育。结果显示，只有TDT能引起显著的荧光增强（相比无酶对照增加27倍），而其他所有测试的酶均未引起明显的荧光信号增加。这表明，基于尺寸扩展碱基的设计策略有效地赋予了探针对TDT的高选择性，同时探针也展现出对水解酶（磷酸酶、ATP酶）的良好稳定性，排除了因非特异性水解导致假阳性信号的可能。

第四部分：在细胞裂解液、活细胞中的应用及高通量抑制剂筛选。 为评估探针在更接近实际应用场景中的性能，研究首先在两种细胞核裂解液中进行测试：高表达TDT的Jurkat细胞（人T淋巴细胞白血病细胞系）裂解液和低表达TDT的HeLa细胞裂解液。将XA探针1加入裂解液孵育后，Jurkat裂解液产生的荧光信号显著高于HeLa裂解液。当用已知的TDT抑制剂Ap5A预处理Jurkat裂解液后，荧光信号被显著抑制，这证明了探针能够区分不同TDT活性的细胞样本，并能反映药物对酶活的抑制效果。初步的活细胞实验通过流式细胞术分析显示，将XA探针1转染入Jurkat细胞后，约有15%的细胞显示出约10倍的荧光增强，而用Ap5A预处理可显著减少荧光细胞的比例，提示探针在细胞内也能被TDT转化。最后，研究评估了基于XA探针1的检测体系用于高通量筛选（HTS）发现TDT抑制剂的可行性。通过计算Z‘因子（>0.5）、信噪比（>2）和变异系数（<20%），确认该体系满足HTS的一般要求。利用该体系对一个包含640种生物活性小分子的化合物库（Tocriscreen 2.0）进行初步筛选，以50 μM浓度筛选并设定60%抑制率为阈值，发现了14个初筛命中化合物。经过二次验证和浓度梯度实验，最终鉴定出两个非核苷类TDT抑制剂：SCH202676 HBr和SUN-B 8155，其IC50值分别为7.0 ± 1.7 μM和9.6 ± 1.9 μM。通过独立的引物延伸实验（使用ddATP和FAM标记引物）进一步证实，SCH202676 HBr能有效抑制TDT的引物延伸活性，表明其抑制作用具有普遍性，且不是通过与探针相互作用产生的假象。

主要研究结果 1. 成功设计与合成了FRET淬灭的尺寸扩展腺苷探针（XA探针1）：该探针在完整状态下荧光被淬灭63倍，为监测酶促反应提供了高信噪比基础。 2. 证实探针是TDT的有效底物：凝胶电泳和质谱分析明确显示TDT能将XA探针1掺入新生DNA链，通常延伸1-2个核苷酸后停止。 3. 实现TDT活性的实时、定量荧光检测：在引物延伸和从头合成两种模式下，荧光信号的增强均与TDT浓度和时间呈正相关，证明了其定量能力。 4. 探针具有优异的选择性与稳定性：对多种高保真DNA聚合酶、磷酸酶和ATP酶均无响应，仅在TDT存在下产生强信号，且在缓冲液中稳定。 5. 在复杂生物样本中有效工作：能在Jurkat细胞裂解液中特异性检测到TDT活性，并能监测抑制剂Ap5A的抑制效果；初步活细胞实验也显示了细胞内转化的迹象。 6. 建立了适用于高通量筛选的检测平台：基于该探针的检测方法各项指标（Z‘因子、信噪比、变异系数）符合HTS标准。 7. 发现了新的TDT抑制剂先导化合物：通过HTS筛选及验证，发现了非核苷类化合物SCH202676 HBr和SUN-B 8155，它们能在微摩尔浓度下有效抑制TDT活性。

研究结论与价值 本研究成功开发了一种基于FRET淬灭和尺寸扩展核苷酸的新型荧光探针（XA探针1），该探针能够直接、实时、高选择性地报告白血病关键生物标志物TDT的酶活性。其科学价值在于：首先，提供了一种研究TDT酶学特性（包括引物延伸和独特的从头合成功能）的新型分子工具，有助于更深入地理解该酶的催化机制。其次，探针优异的选择性（源于尺寸扩展碱基）为在复杂生物环境中特异性检测TDT提供了可能，克服了现有方法的一些关键局限。在应用价值方面：第一，该探针及配套的荧光检测方法操作简便、快速，具有转化为临床诊断工具的潜力，可用于白血病患者样本中TDT活性的检测与监测。第二，利用该探针建立的HTS兼容性检测体系，为发现和开发新型TDT抑制剂（作为潜在的抗癌药物）提供了高效平台，并已成功鉴定出具有进一步开发价值的先导化合物SCH202676 HBr。第三，该研究展示了将合成核苷酸化学与酶学检测相结合，用于解决生物医学关键问题的成功范例。

研究亮点 1. 创新性的探针设计：巧妙结合尺寸扩展核苷酸（实现选择性）和FRET淬灭机制（实现信号开关），构建了首个能够直接、实时报告TDT活性的荧光探针。 2. 多功能检测能力：探针不仅能监测传统的引物延伸活性，还能高效监测TDT独特的从头合成活性，为全面研究该酶功能提供了工具。 3. 出色的选择性与生物相容性：探针对TDT具有高度特异性，在多种干扰酶存在下保持稳定，并成功应用于细胞裂解液和活细胞水平的检测，显示出良好的生物应用前景。 4. 成功衔接基础研究与药物发现：研究不仅停留在探针开发和体外验证阶段，更进一步将其应用于真实的生物样本检测和高通量药物筛选，并取得了实质性发现（新的抑制剂先导化合物），实现了从方法学到潜在应用的完整闭环。

其他有价值的发现 研究过程中一个有趣的观察是，在“从头合成”模式下，使用XA探针1产生的荧光信号增强比“引物延伸”模式更显著。作者推测这可能反映了TDT活性位点在无引物结合时对庞大尺寸扩展碱基的容纳度更高，这一现象本身为进一步研究TDT的催化结构和机制提供了线索。此外，研究中用于验证筛选命中化合物的独立二级实验（基于引物延伸和ddATP的凝胶实验）设计严谨，有效排除了化合物可能通过干扰探针本身而产生假阳性抑制信号的可能性，为基于该探针的后续筛选工作建立了可靠的验证标准。