本研究的主要作者为Ying-Chieh Wu、Šárka Lehtonen、Kalevi Trontti等，通讯作者为Šárka Lehtonen、Jari Koistinaho和Taisia Rolova。研究团队主要来自芬兰的多所大学及研究机构，包括赫尔辛基大学和东芬兰大学。该项研究成果发表于2024年的开放获取期刊《Fluids and Barriers of the CNS》。

本研究属于神经退行性疾病和血管生物学交叉领域。其学术背景是：阿尔茨海默病（Alzheimer‘s disease， AD）患者常伴有脑淀粉样血管病（cerebral amyloid angiopathy, CAA），即β-淀粉样蛋白（beta-amyloid, Aβ）在脑血管壁的异常积累，这会导致脑血管功能障碍，被认为是AD中血管病变和脑血流灌注不足的重要基础。周细胞是包绕在毛细血管周围的血管壁细胞，对调节脑血流、血管生成和血管稳定性至关重要。尽管已知血管功能障碍影响神经退行性疾病的进展，但周细胞在AD病理中的具体作用尚不明确。为了探究这一点，研究团队旨在利用携带与家族性AD相关的淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）“瑞典突变”（Swedish mutation, APPswe）的人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, iPSCs），建立并研究一个人类血管周细胞模型。本研究的目的是：探究APPswe突变是否会影响周细胞的功能，并试图阐明这些细胞在AD相关CAA病理机制中的潜在作用。

研究的工作流程主要包括以下几个步骤，涵盖了模型建立、功能评估和多组学分析。 1. 人类iPSC来源的周细胞样细胞（iPSC-pericyte-like cells, iPLCs）的建立与表征： * 研究对象与样本量：研究使用了总计10个iPSC系，包括3个携带APPswe突变的细胞系（AD1， AD2， AD3）和7个来自健康对照的细胞系（Ctrl1-Ctrl7）。具体实验会从中选择特定细胞系进行组合。 * 细胞分化：采用并优化了Blanchard等人（2020）的定向分化方案，通过中胚层谱系将iPSCs分化为iPLCs。分化过程历时约21-23天。 * 细胞表征实验： * 免疫细胞化学：检测了多个经典的周细胞/血管壁细胞标志物，包括血小板衍生生长因子受体β（PDGFRβ）、神经胶质抗原2（NG2）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）。结果显示分化后的iPLCs均阳性表达这些标志物。 * qRT-PCR：检测了多个周细胞富集基因（如PDGFRB、DES、LAMA2、PDE7B、DLC1）的表达，结果显示iPLCs中这些基因的表达水平显著高于未分化的iPSCs、iPSC来源的内皮细胞（iPSC-endothelial cells, iECs）和星形胶质细胞（iAstrocytes），证实了其周细胞样特征。 * 分化时间点优化：通过在不同时间点（第7、21、31、50天）检测基因表达，发现第21-31天时细胞表现出稳定的周细胞样特征，因此选定此时间段进行后续实验。 2. iPLCs基础功能验证： * 血管生成支持实验： * 二维管状结构形成实验：将iPLCs与iECs在基质胶上共培养。结果显示，单独的iECs或iPLCs均无法形成有效的管状网络。而iECs与iPLCs直接共培养时，能形成复杂且稳定的管状结构（主分支数、网孔数、网孔面积均显著增加），其效果与使用血管生成因子鸡尾酒处理iECs相当。这表明iPLCs能有效支持并稳定血管形成。 * 屏障完整性支持实验： * 渗透性分析：采用Transwell模型，将iPLCs接种在基底侧，iECs接种在顶侧，构建共培养体系。使用4 kDa和70 kDa荧光标记的葡聚糖评估内皮层通透性。 * 结果：与单独的iECs层相比，与iPLCs共培养显著降低了两种分子量葡聚糖的通透系数，表明iPLCs增强了内皮屏障的完整性。 * 紧密连接蛋白分析：通过蛋白质印迹法检测紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的水平，结果显示iPLCs的存在并未显著改变这些蛋白的RIPA可溶性水平，提示其增强屏障功能的机制可能不依赖于增加这些蛋白的总量。 3. APPswe突变对iPLCs的表型影响研究： * 基因和蛋白表达变化： * qRT-PCR和蛋白质印迹：发现APPswe iPLCs中PDE7B和DES的mRNA表达下调，而编码α-SMA的基因ACTA2表达上调。蛋白质水平也证实α-SMA在APPswe iPLCs中显著升高。 * 免疫荧光：进一步显示APPswe iPLCs中α-SMA更多以“应力纤维”的形式存在，而对照细胞中α-SMA主要弥散分布在细胞边缘。定量显示APPswe组中含有应力纤维的细胞比例显著增高。 * Aβ代谢研究： * Aβ分泌：通过ELISA检测细胞培养基。关键发现是，APPswe iPLCs分泌的Aβ1-42水平是对照细胞的约10倍，Aβ1-40水平也显著升高（约3.5倍）。这证明周细胞自身能够产生Aβ，且APPswe突变导致其过度生产，尤其是更具毒性的Aβ1-42。 * 相对贡献度比较：与同源的APPswe神经元和星形胶质细胞相比，iPLCs产生的Aβ总量要低约100倍，提示其在全脑淀粉样负荷中的直接贡献可能有限，但鉴于其血管壁定位，对血管局部的淀粉样沉积可能有重要影响。 * Aβ摄取：使用荧光标记的Aβ1-42处理细胞，发现无论是对照还是APPswe iPLCs，其摄取Aβ的能力都很低（约3%的细胞阳性），且基因型无差异。 4. 转录组学分析（RNA-Seq）： * 数据分析方法：对21天分化的对照和APPswe iPLCs进行RNA测序。使用STAR进行序列比对，DESeq2进行差异表达基因分析。设置阈值（FDR < 0.05，绝对log2倍数变化 > 1.5）鉴定出687个差异表达基因。 * 通路富集分析：使用Ingenuity Pathway Analysis和Pathview进行。 * 主要发现： * 上调通路：主要与细胞骨架重组和收缩相关，如整合素信号、Paxillin信号、Rho家族GTP酶信号和肌动蛋白细胞骨架信号通路。这与观察到的α-SMA应力纤维表型一致。 * 下调通路：涉及内皮素-1（ET-1）信号、缺氧诱导因子1α（HIF1α）信号和白介素-8（IL-8）信号等，这些通路与血管收缩、血管生成和炎症调节相关。 * 基因本体分析：进一步支持在生物过程和细胞组分层面，与血管/肌肉功能和细胞外基质组织相关的条目显著富集。 5. APPswe iPLCs的功能缺陷验证： * 炎症反应：使用肿瘤坏死因子-α（TNFα）和白介素-1β（IL-1β）刺激细胞。通过细胞因子珠阵列检测发现，APPswe iPLCs在刺激后分泌的单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1/CCL2）水平显著高于对照细胞，血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）也有升高趋势。 * 血管生成支持能力受损： * 管状形成实验：与APPswe iPLCs共培养的iECs，形成的管状网络复杂性（主分支数和网孔数）显著低于与对照iPLCs共培养的组。这与转录组中血管内皮生长因子A（VEGFA）及其受体KDR等促血管生成基因表达下调的发现相符。 * 屏障支持能力受损： * 渗透性分析：与APPswe iPLCs共培养的iECs层，对葡聚糖的通透性显著高于与对照iPLCs共培养的组，甚至恢复到与单独iECs层相似的水平，表明APPswe iPLCs丧失了增强屏障完整性的能力。 * 有趣的是，蛋白质印迹显示APPswe共培养体系中ZO-1和Occludin的蛋白水平反而更高，提示屏障功能障碍并非由于这些蛋白降解所致，可能与蛋白质定位或其它信号通路异常有关。 * 收缩功能异常： * 收缩力测定：使用实时细胞分析系统（xCelligence）监测细胞阻抗变化来反映细胞收缩/舒张。给予血管收缩剂内皮素-1（ET-1）后，APPswe iPLCs表现出更强的初始收缩斜率，并且恢复到基线大小所需的时间显著延长，表现出“高收缩性”和“恢复延迟”的表型。 * 下游信号：蛋白质印迹分析显示，ET-1刺激后，APPswe iPLCs中磷酸化ERK（p-ERK）与总ERK的比值在10分钟时点的增幅大于对照细胞，提示ERK信号通路可能过度激活，这可能介导了其异常的收缩反应。

本研究的主要结论是：携带家族性AD相关APPswe突变的人iPSC来源周细胞样细胞（iPLCs），在体外成功模拟了脑淀粉样血管病（CAA）的多个关键病理特征。这些特征包括：1）Aβ过度生产：特别是Aβ1-42的分泌量激增；2）功能缺陷：支持血管生成和维持内皮屏障完整性的能力受损，以及在炎症刺激下产生过量趋化因子MCP-1；3）高收缩表型：对血管收缩剂ET-1的反应表现为过度且持久的收缩。转录组学分析进一步将这些功能异常与细胞骨架重组、细胞外基质相关基因的上调，以及血管生成、收缩相关信号通路的下调联系起来。

本研究的价值和意义体现在多个层面： * 科学价值： 1. 机制新见解：首次在人类细胞模型中明确证实，周细胞自身可以产生Aβ，并且AD相关的APP突变会直接导致周细胞Aβ（特别是Aβ1-42）的过度生产，为CAA的血管源性淀粉样蛋白假说提供了直接且有力的实验证据。 2. 病理关联性：将APPswe周细胞的多种功能缺陷（屏障破坏、血管生成受损、异常收缩和炎症反应）与AD/CAA的已知临床病理特征（血脑屏障渗漏、毛细血管稀疏、脑血流调节异常和神经炎症）建立了因果联系，凸显了周细胞功能障碍在AD血管病理中的核心作用。 3. 模型系统验证：成功建立并验证了一个高度可控、具有疾病相关遗传背景的人源化iPSC-周细胞模型，为研究神经血管单元在健康和疾病状态下的功能提供了强大工具。 * 应用价值： 1. 药物发现平台：该模型可作为高通量药物筛选平台，用于发现能够逆转或改善周细胞功能障碍、稳定血脑屏障、或减少血管源性Aβ产生的候选化合物，为开发针对AD血管病理的新型联合疗法铺平道路。 2. 转化研究桥梁：连接了AD的遗传风险因素、细胞水平的功能表型和临床症状，有助于识别新的生物标志物和治疗靶点（如MCP-1、异常的ERK信号或细胞骨架调节因子）。

本研究的亮点在于： 1. 重要发现的新颖性：揭示了周细胞作为Aβ“生产者”的新角色，及其APPswe突变导致的“多重功能衰竭”表型，深化了对CAA和AD血管病变机制的分子和细胞水平理解。 2. 研究方法的先进性与系统性： * 人类iPSC模型：克服了原代周细胞难以获取和培养的局限，提供了遗传背景清晰、可扩展的人源细胞来源。 * 多维度功能评估：整合了血管生成、屏障渗透性、细胞收缩、炎症反应和Aβ代谢等多个关键功能学检测，全面刻画了突变周细胞的病理表型。 * 整合组学分析：通过RNA-Seq将观察到的表型变化与全基因组范围的转录组改变相关联，提供了潜在的分子机制线索，使研究发现更具深度和说服力。 * 精密的实验设计：包括严格的时间点控制、多种对照设置（健康对照、同基因型对照、细胞类型对照）以及数据归一化方法，确保了结果的可靠性。 3. 研究对象的特殊性：聚焦于在AD中至关重要但研究相对不足的血管周细胞，利用携带明确致病突变（APPswe）的细胞系，直接模拟了家族性AD的遗传背景，使研究具有高度的疾病相关性。

此外，研究中还包含其他有价值的内容，例如对分化过程中周细胞标志物表达动态的跟踪，有助于优化分化方案；对周细胞吞噬功能的初步评估，提示本模型中的iPLCs可能不具备强吞噬活性；以及对VEGF-A蛋白水平的检测，发现其与mRNA变化不完全一致，提示了转录后调控的可能性。这些细节为后续研究提供了参考方向。该研究是一项系统、深入且具有突破性的工作，为理解AD的血管病理机制和开发新型治疗策略做出了重要贡献。