本研究由中国科学院天津工业生物技术研究所的Chen Yang、Xuanlong Sun、Haiyan Ju、Xinmin Yue、Chaoyou Xue，以及中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）的Zhiwei Zhou、Shuquan Rao等人共同完成。论文于2024年5月28日发表于 Cell Reports 期刊。该研究围绕CRISPR-Cas9基因编辑系统中PAM（protospacer-adjacent motif，原间隔序列邻近基序）识别限制的工程化改造问题，系统探究了PAM宽松型SpCas9变体SpG和SpRY在靶标搜索与切割效率方面的分子机制。

研究背景

CRISPR-Cas9系统依赖Cas9核酸酶识别靶DNA上的PAM序列，从而启动DNA解旋和向导RNA（sgRNA）与靶序列的互补配对检查。天然SpCas9识别NGG PAM，这一限制显著约束了基因组可编辑区域的范围。为突破该限制，研究者通过蛋白质工程获得了SpG（识别NGN PAM）和SpRY（识别NRN>NYN PAM，几乎无PAM限制）等变体。然而，PAM在进化上不仅用于区分自身与非自身DNA，还在靶标搜索动力学中发挥关键作用。PAM松弛后，Cas9需要检查基因组中的几乎每一个序列，理论上会大幅减慢靶标搜索速度并降低切割效率。此前实验显示SpG和SpRY虽PAM兼容性提高，但在功能位点上的编辑效率波动很大（0%–70%），其背后的分子机制尚不清楚。本研究旨在揭示PAM宽松型变体如何在PAM识别松弛后仍能高效定位并切割靶标，从而为未来无PAM Cas9工程化提供理论指导。

研究流程与实验方法

研究分为四个主要部分。第一部分利用体内质粒丢失动力学实验和高通量测序比较了SpCas9、SpG和SpRY的靶标切割速率及序列偏好。研究者在F质粒上表达Cas9变体，在pSC101质粒上携带靶序列和sgRNA，通过阿拉伯糖诱导Cas9表达引发切割，并以荧光蛋白mscarlet作为报告系统实时监测质粒丢失速率。结果显示SpG和SpRY的切割速率分别约为0.433 h⁻¹和0.365 h⁻¹，仅略低于SpCas9的0.485 h⁻¹，表明PAM松弛未显著降低靶标定位速度。为进一步解析序列识别特征，研究设计了包含7个随机化位点（种子区1–3位和PAM区）的寡核苷酸库，分别转入表达SpCas9、SpG、SpRY及SpRY突变体（R61A、R1322A）的细胞中，经阿拉伯糖诱导后高通量测序，分析被切割删除（depleted）的序列特征。结果显示SpCas9主要识别NGG PAM；SpG在识别NGN PAM的同时，对靶序列第1位呈现K（G/T）偏好；而SpRY除识别NRN>NYN PAM外，还在种子区第1–3位呈现R3G2K1的偏好。研究者进一步通过体外切割实验验证了这一偏好：以含AGG PAM且种子区为A3G2G1的靶DNA为模板，系统替换第1–3位的碱基，测定SpCas9、SpG和SpRY的切割速率。SpCas9对所有9种底物切割速率接近（0.375 s⁻¹），SpG对含K1的底物切割速率（0.106 s⁻¹）显著高于非K1底物（0.019 s⁻¹），而SpRY对R3G2K1底物切割速率最高（0.045 s⁻¹），任一位置替换均导致切割速率下降数倍至上百倍。

第二部分通过结构模拟探究SpRY识别种子区序列的分子机制。研究利用AlphaFold2生成SpRY结构，并使用HADDOCK进行SpRY与双链DNA的对接模拟。模型显示R1322残基与PAM邻近的非靶标链磷酸骨架形成静电相互作用，这解释了对第1位K的偏好；R61残基则与种子区第3位鸟嘌呤的O6或胸腺嘧啶的O4处于氢键距离内，对应R3偏好。第2位G的偏好虽未在结构模型中直接观察到蛋白与碱基的接触，但高通量测序数据表明R61和R1322共同参与G2偏好的形成。为验证这些残基的功能，研究者分别构建了R61A和R1322A突变体，并进行体内高通量测序。R61A突变体失去了第2和第3位的序列偏好，但仍保留第1位偏好；R1322A突变体则减弱了第1和第2位的偏好。值得注意的是，R61A突变使序列删除比例从SpRY的5.4%上升至14.5%，而R1322A突变则使其下降至2.5%，提示第1位识别对靶标切割效率的贡献更为关键。

第三部分探讨了SpCas9靶标搜索动力学与PAM密度的关系。研究建立了一个靶标搜索模型：SpCas9通过三维碰撞随机结合DNA，然后进行短距离一维滑动（约8–20 bp），若在滑动距离内遇到PAM则启动DNA解旋和序列检查。若一次滑动中遇到n个PAM位点，SpCas9会在这些位点间反复穿梭，耗时与n²成正比。研究者通过体外竞争实验验证了这一模型：在靶DNA中加入含不同数量PAM（1、2、4、8、16个）的竞争DNA，测定SpCas9对靶DNA的切割速率。结果显示随着竞争DNA中PAM密度增加，SpCas9在竞争DNA上的停留时间呈指数增长，靶标切割显著延迟，最高可降低三个数量级。此外，研究利用Gillespie算法和蒙特卡洛模拟两种独立方法估算了SpCas9的最优滑动距离。Gillespie模拟显示在1 μM SpCas9浓度下，最优解离速率约5 s⁻¹，对应滑动距离为8–13 nt；蒙特卡洛模拟则给出15–20 nt的最优滑动距离。两者均与实验测得的滑动距离一致，表明SpCas9已进化至接近最优的搜索效率。基于该模型，研究估算单个SpCas9在大肠杆菌基因组中寻找靶标约需36小时，远高于实验测得的4–12小时，差异可能源于细胞内拥挤环境缩短了三维碰撞时间。

第四部分结合上述结果提出无PAM Cas9工程化的两条可行路径。第一条是两步法蛋白质工程：首先通过突变减弱SpCas9与DNA的非特异性静电相互作用，消除一维滑动特性，使其仅依赖三维碰撞进行搜索；然后再消除PAM识别限制。该方案虽然会使总搜索时间增加约17倍，但仍在合理范围内。第二条路径是使用多种识别不同PAM的Cas核酸酶组合，共同覆盖所有可能的序列，从而在保持搜索效率的同时实现全基因组可编辑。

主要结果

本研究的主要发现包括：（1）SpG和SpRY在PAM识别松弛的同时，在靶序列种子区获得了新的序列偏好，SpG偏好第1位K，SpRY偏好第1–3位R3G2K1；（2）SpRY的种子区偏好由其R61和R1322残基介导，R61主要识别第3位嘌呤，R1322主要识别第1位K，两者协同贡献第2位G偏好；（3）PAM密度增加会指数级延长SpCas9的靶标搜索时间，证明PAM宽松型变体仍需识别某些序列以保证搜索效率；（4）SpCas9的最优滑动距离为8–20 nt，与理论最优一致，提示进化已优化其搜索策略。

结论与意义

该研究证实了PAM松弛型SpCas9变体通过重新获得种子区序列偏好来补偿PAM识别功能的丧失，从而在PAM密度接近全基因组的情况下仍保持较快的靶标定位和切割速率。这一发现解释了此前SpG和SpRY在功能位点上编辑效率差异巨大的原因，并为设计高效sgRNA提供了序列准则。更重要的是，研究揭示了Cas9靶标搜索动力学在无PAM工程化中的关键作用，指出单纯放松PAM限制可能导致搜索时间急剧增加和切割效率下降。为此，研究提出了两步工程化或多种Cas组合的策略，为未来开发真正无PAM限制的高效Cas9变体提供了理论框架和实践方向。

研究亮点

本研究的亮点在于：首次系统证明SpG和SpRY在种子区存在序列偏好，并通过结构模拟和突变实验阐明了其分子基础；揭示了PAM密度对Cas9搜索动力学的定量影响，提出n²穿梭模型；结合两种独立模拟方法确定了SpCas9的最优滑动距离；提出了无PAM Cas9工程化的新策略。此外，研究中使用的体内高通量测序文库结合荧光质粒丢失动力学的方法，为评估Cas9变体的靶标搜索和切割特性提供了高效平台。