多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种中枢神经系统（central nervous system，CNS）的自身免疫性疾病，其病理特征之一是外周自身反应性淋巴细胞穿过受损的血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）进入中枢神经系统，引发脱髓鞘和神经轴突变性。目前临床上用于治疗多发性硬化的疾病修正治疗（disease-modifying therapies，DMTs）药物主要通过抑制外周T细胞和B细胞的增殖来减轻中枢神经系统内的炎症反应，但对已经受损的血脑屏障的直接修复作用有限。因此，寻找既能抑制异常免疫反应又能促进血脑屏障修复的治疗策略，对于改善多发性硬化患者的长期预后具有重要意义。
特立氟胺（Teriflunomide）是一种已获批用于治疗复发缓解型多发性硬化（relapsing-remitting multiple sclerosis，RRMS）的一线口服疾病修正治疗药物，其经典作用机制是通过抑制二氢乳清酸脱氢酶（dihydroorotate dehydrogenase，DHODH）来阻断淋巴细胞增殖。然而，特立氟胺在血脑屏障保护方面的直接作用此前尚不清楚。基于这一研究空白，来自中山大学附属第三医院神经内科的Wei Qiu团队及其合作者开展了一项旨在探究特立氟胺对多发性硬化血脑屏障完整性影响的基础与临床研究。该研究成果于2023年10月11日在线发表于Molecular Neurobiology杂志，文章标题为《Teriflunomide Promotes Blood-Brain Barrier Integrity by Upregulating Claudin-1 via the Wnt/β-Catenin Signaling Pathway in Multiple Sclerosis》。本文的第一作者为Yipeng Zhao、Chen Chen和Xiuqing Xiao，通讯作者为Wei Qiu。研究团队综合利用实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）动物模型、多发性硬化患者临床样本、体外人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells，HBMECs）血脑屏障模型以及RNA测序技术，系统揭示了特立氟胺通过Wnt信号通路促进紧密连接蛋白Claudin-1表达、进而增强血脑屏障完整性的新机制。
该研究的学术背景涉及多发性硬化的血脑屏障病理机制及特立氟胺的多效性作用。血脑屏障主要由脑微血管内皮细胞及其之间的紧密连接（tight junctions，TJs）构成。紧密连接蛋白包括Claudin家族、Occludin以及闭锁小带蛋白（zonula occludens，ZO）等，它们在维持血脑屏障低通透性方面发挥核心作用。在多发性硬化发病过程中，活化的T细胞释放多种炎性细胞因子，破坏内皮细胞间紧密连接结构，导致血脑屏障通透性增加，促使更多的免疫细胞和有害分子进入中枢神经系统。既往研究显示，特立氟胺除抑制DHODH外，还可调节多种信号通路，如钙池操纵性钙内流（store-operated calcium entry，SOCE）、MAPK和p53等，但这些作用是否涉及血管内皮细胞功能及血脑屏障修复目前缺乏直接的实验证据。因此，本研究旨在验证特立氟胺对血脑屏障完整性的保护效应，并阐明其潜在的分子机制。
在研究流程方面，该研究主要包含体内动物实验、体外细胞实验、临床患者样本分析以及RNA测序四个相互关联的部分。首先，在体内实验中，作者采用Lewis大鼠诱导EAE模型，观察预防性和治疗性给予特立氟胺对EAE临床评分的影响。结果显示，在免疫诱导当天（预防性）或发病后第10天（治疗性）给予特立氟胺（10 mg/kg，每日灌胃）均可显著降低EAE大鼠的临床评分。进一步通过尾静脉注射Evans Blue染料评估血脑屏障通透性，发现EAE大鼠中枢神经系统中Evans Blue的扩散明显增加，而特立氟胺治疗可有效减少染料在中枢神经系统的渗透。此外，血清中神经丝轻链（neurofilament light chains，NfLs）的漏出水平在特立氟胺治疗后也显著降低。免疫荧光结果显示，EAE大鼠脊髓组织中ZO-1、Claudin-5和Occludin的表达均明显下降，而特立氟胺治疗可部分恢复这些紧密连接蛋白的表达，尤其是显著增加了Claudin-5的水平。这些实验结果初步表明特立氟胺在体内具有血脑屏障保护作用。
在体外实验中，作者采用人脑微血管内皮细胞（HBMECs）建立了血脑屏障体外模型，并通过测量跨内皮电阻（transendothelial electrical resistance，TEER）和荧光素钠（sodium fluorescein，NaF）的通透性来评价屏障完整性。结果显示，20 μM和30 μM的特立氟胺处理48小时可显著提高HBMECs的细胞活力。与其他两种疾病修正治疗药物芬戈莫德和富马酸二甲酯相比，仅特立氟胺在该浓度范围内对内皮细胞活力表现出正向调节作用。在血脑屏障模型中，特立氟胺可显著增加TEER并降低NaF的透过率。此外，研究还利用肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）和干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）诱导内皮细胞炎性损伤，以及利用甘露醇模拟非炎性屏障开放，结果均显示特立氟胺能够减轻这些损伤引起的屏障功能障碍。这些体外数据强烈支持特立氟胺对内皮细胞和血脑屏障具有直接保护作用。
在分子机制层面，作者通过实时定量PCR和Western blot检测发现，特立氟胺可显著上调HBMECs中Claudin-1的基因和蛋白表达水平，同时免疫荧光显示Claudin-1在细胞质和细胞膜上的分布均增加。通过小干扰RNA（siRNA）敲低Claudin-1后，特立氟胺增强血脑屏障TEER的作用被消除，NaF通透性也恢复至对照组水平，表明Claudin-1在特立氟胺介导的屏障保护效应中是不可或缺的。
为了进一步探索特立氟胺调控Claudin-1表达的上游信号通路，作者对特立氟胺处理和未处理的HBMECs进行了RNA测序分析。结果显示，特立氟胺处理后多个基因表达发生显著改变，其中Wnt信号通路受到明显影响。KEGG富集分析表明Wnt信号通路在给药后显著上调，特别是Wnt2b的基因和蛋白表达水平在HBMECs中明显增加。此外，在特立氟胺治疗的EAE大鼠脊髓组织中也观察到Wnt2b的表达升高。Wnt信号通路已知在血脑屏障形成和维持中发挥关键作用，因此作者假设Claudin-1的表达受到Wnt/β-catenin信号通路的调控。为验证这一假设，作者使用Wnt信号通路抑制剂LGK974和IWR-1处理HBMECs。LGK974抑制Wnt分泌，而IWR-1通过稳定Axin蛋白抑制β-catenin从降解复合物中释放，两者分别作用于Wnt信号通路的上游和下游。结果显示，两种抑制剂均显著抑制了特立氟胺诱导的Claudin-1基因和蛋白上调，同时阻断了特立氟胺提高TEER和降低NaF透过率的作用。此外，通过siRNA敲低β-catenin基因（CTNNB1）后，特立氟胺对Claudin-1表达的促进作用以及对血脑屏障完整性的改善效应均被明显削弱。这些结果综合证明特立氟胺通过激活Wnt/β-catenin信号通路上调Claudin-1表达，进而增强血脑屏障完整性。
为验证Wnt信号激活是否足以模拟特立氟胺的屏障保护作用，作者进一步使用Wnt信号激动剂R-spondin1和SKL2001处理HBMECs。实验结果表明，单独激活Wnt信号即可显著提高Claudin-1的基因和蛋白表达水平，并增强血脑屏障模型的TEER、降低NaF透过率。在炎性损伤模型中，Wnt激动剂也能改善受损的屏障功能。更重要的是，在体内实验中，对EAE大鼠予以R-spondin1治疗后，其临床评分明显下降，中枢神经系统Evans Blue渗透减少，血清NfLs水平降低，同时脊髓脱髓鞘程度减轻。免疫荧光结果显示，R-spondin1处理可使EAE大鼠脊髓中Claudin-1和β-catenin的表达恢复。这些结果进一步说明了激活Wnt/β-catenin信号促进Claudin-1表达足以恢复血脑屏障完整性并减轻EAE病程。
在临床样本分析中，作者纳入了复发缓解型多发性硬化患者和健康对照者，比较了血清NfLs水平。结果显示，未接受疾病修正治疗的多发性硬化患者血清NfLs水平明显高于健康对照者，而接受特立氟胺治疗的患者血清NfLs水平较未治疗患者显著降低。此外，对部分患者进行动态对比增强磁共振成像（dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging，DCE-MRI）检查，以血脑屏障通透性参数Ktrans和kep评价屏障损伤程度。结果显示，特立氟胺治疗超过6个月后，患者Ktrans和kep值较未治疗或短期治疗者明显降低，表明血脑屏障通透性得到改善。在个案图像分析中，一名患者在接受特立氟胺治疗3个月和6个月后，其血脑屏障损伤在6个月时改善更为明显；而另一名接受芬戈莫德治疗6个月的患者，尽管临床扩展残疾状态量表（EDSS）评分有所下降，但影像所示血脑屏障恢复不明显。这些临床数据提示特立氟胺在多发性硬化患者中可能具有比其他疾病修正治疗药物更优的血脑屏障修复效果。
本研究的核心结论为：特立氟胺通过激活脑微血管内皮细胞中Wnt/β-catenin信号通路并上调紧密连接蛋白Claudin-1的表达，增强了血脑屏障的完整性，从而在多发性硬化中发挥了新的保护作用。这一发现不仅丰富了特立氟胺的药理作用机制，还为多发性硬化及其他伴有血脑屏障损伤的神经炎症性疾病的治疗提供了新的思路。研究的创新点在于：第一，首次系统证明特立氟胺对血脑屏障的直接保护效应；第二，揭示了Wnt/β-catenin/Claudin-1这一新信号轴在特立氟胺屏障保护中的作用；第三，结合EAE动物模型、体外细胞模型和多发性硬化患者影像及血清标志物，从多层次验证了研究结论。研究的局限性主要是临床样本量相对较小，且DCE-MRI随访资料有限，但整体上该研究为特立氟胺在血脑屏障修复方面的应用提供了较为有力的实验证据。