作者及机构
本研究由甘肃农业大学基础兽医学系的Xuefeng Bai、Hongqin Lu、Rui Ma、Sijiu Yu（通讯作者）、Shanshan Yang、Junfeng He和Yan Cui（通讯作者）团队完成，发表于2025年4月的期刊《Biomolecules》（2025, 15, 556），DOI: 10.3390/biom15040556。
研究领域：本研究聚焦于慢性肾脏疾病（CKD）的核心病理特征——肾纤维化，探讨高原物种牦牛（Bos grunniens）在长期缺氧环境下避免肾纤维化的分子机制。
研究动机：肾纤维化是CKD进展至终末期肾病（ESRD）的关键驱动因素，缺氧可通过激活上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）和氧化应激促进纤维化。然而，长期生活在海拔3000米以上的牦牛虽处于慢性缺氧环境，却未出现肾纤维化损伤，其保护机制尚不明确。
科学问题：牦牛如何通过缺氧适应性机制抵抗肾纤维化？本研究提出假设：线粒体自噬（mitophagy）可能通过抑制铁死亡（ferroptosis）通路发挥保护作用。
1. 样本与伦理
- 研究对象：6头成年雄性牦牛（高海拔>3000米）和6头低海拔黄牛（1000米）。
- 组织处理：肾脏组织分为三组——4%多聚甲醛固定（组织学分析）、-80°C保存（蛋白质印迹）、生理盐水冲洗（原代细胞培养）。
2. 组织学与免疫组化
- 染色技术：H&E（细胞结构）、Masson和Sirius Red（胶原纤维定量）。
- 关键发现：牦牛肾小管数量显著多于黄牛（p<0.01），但胶原体积分数无差异。
- 蛋白检测：免疫组化显示牦牛肾脏中p-AMPK/AMPK、Parkin、PINK1、LC3II/I和Beclin1表达上调，p-mTOR/mTOR下调。
3. 细胞实验
- 细胞模型：原代培养牦牛和黄牛肾小管上皮细胞（RTECs），分别暴露于常氧（21% O₂）和缺氧（5% O₂）环境72小时。
- 药物干预：
- 线粒体自噬调节：抑制剂Mdivi-1（200 μM）和激活剂二甲双胍（Metformin, 2 mM）。
- 铁死亡调节：激活剂RSL3（1 μM）和抑制剂Ferrostatin-1（20 μM）。
- 检测指标：
- 线粒体功能：JC-10探针检测膜电位，Mitotracker/Lysotracker共定位观察线粒体-溶酶体融合。
- 氧化应激：DCFH-DA探针测ROS，C11-BODIPY检测脂质氧化。
- 分子标记：Western blot分析EMT（E-cadherin、Vimentin）、纤维化（α-SMA、Collagen I）和铁死亡（SLC7A11、GPX4）相关蛋白。
4. 纤维化模型构建
- 诱导剂：顺铂（Cisplatin, 100 μM）和RSL3联合二甲双胍处理，通过CCK-8确定最佳浓度。
- 自噬观察：腺病毒载体mCherry-GFP-LC3B标记自噬体形成。
1. 高原适应机制
- 牦牛肾脏在缺氧下通过激活AMPK/PINK1-Parkin通路增强线粒体自噬，同时抑制mTOR信号（图1f,g）。
- 缺氧初期（24小时）牦牛RTECs出现短暂EMT激活（α-SMA↑），但48-72小时后恢复稳态（图2g,h），而黄牛RTECs持续纤维化。
2. 线粒体自噬抑制纤维化
- 二甲双胍激活自噬后：
- EMT标志物E-cadherin表达上升，Vimentin、α-SMA下降（图4d-g）。
- 铁死亡抑制：SLC7A11和GPX4表达升高，GSH水平增加，MDA和Fe²⁺积累减少（图5e,f）。
3. 铁死亡的核心作用
- RSL3诱导铁死亡后：β-catenin（上皮标志）↓、Vimentin↑，胶原沉积加剧；Ferrostatin-1则逆转此效应（图6e-i）。
- 在顺铂纤维化模型中，二甲双胍通过降低ROS/MDA，缓解铁死亡（图7c-f）。
科学意义：
1. 首次揭示牦牛通过慢性缺氧激活线粒体自噬，清除受损线粒体并减少ROS积累，从而抑制铁死亡通路。
2. 提出“线粒体自噬-铁死亡-纤维化”调控轴，为高原适应生理学提供新视角。
应用潜力：
- 靶向AMPK/PINK1-Parkin通路或可开发抗肾纤维化药物。
- 铁死亡抑制剂（如Ferrostatin-1）在CKD治疗中具有转化价值。
局限性：未探讨其他抗纤维化机制（如HIF-2α或糖代谢）的潜在贡献，未来需多组学联合分析。
（注：原文中所有实验数据均通过GraphPad Prism 8.3.0分析，统计学显著性设定为p<0.05。）