心肌细胞来源的 GPX4 通过稳定 BNIP3 促进线粒体自噬并减轻心肌缺血/再灌注损伤

主要作者与发表信息 本研究由钟凌峰、程振峰、张钰聪等学者共同完成，通讯作者为尹德领、黄伟剑和叶博志。研究团队主要来自温州医科大学第一附属医院、浙江大学医学院第二附属医院等中国研究机构。该原创性研究成果于2026年发表在《Nature Communications》期刊上。

研究背景 急性心肌梗死是全球范围内导致死亡的主要原因之一。目前的标准治疗方法是通过溶栓治疗或直接经皮冠状动脉介入治疗实现快速有效的心肌再灌注。然而，再灌注本身可能引发额外的心肌损伤，这一现象被称为心肌缺血/再灌注损伤。再灌注损伤可触发多种形式的心肌细胞死亡，包括凋亡、自噬、焦亡以及铁死亡。由于心肌细胞属于终末分化细胞且再生能力有限，抑制心肌细胞死亡对于保护再灌注后的心脏功能至关重要。

铁死亡是一种依赖于铁离子的脂质过氧化物积累所驱动的程序性细胞死亡形式，在心肌缺血/再灌注损伤的发病机制中扮演着关键角色。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是清除脂质过氧化物的关键酶，被认为是铁死亡的核心调控因子。已有研究表明，心肌缺血/再灌注损伤与GPX4的表达下调相关，而上调GPX4则显示出减轻心肌损伤、改善心脏功能的潜力。然而，GPX4在心肌缺血/再灌注损伤中线粒体功能障碍方面的具体作用和分子机制尚不清晰。另一方面，线粒体自噬通过选择性降解受损线粒体来维持线粒体质量，对心肌细胞存活至关重要。BNIP3是一个重要的线粒体自噬受体，在线粒体质量控制中发挥关键作用，但GPX4与BNIP3介导的线粒体自噬之间的直接关联此前尚缺乏深入理解。基于此，本研究旨在阐明GPX4在心肌缺血/再灌注损伤中的作用及其分子机制。

研究流程与实验方法 为探究上述科学问题，研究团队设计并执行了多层次、多步骤的实验流程。

首先，研究者探索了铁死亡在心肌缺血/再灌注损伤早期阶段的作用。他们通过在小鼠心肌缺血/再灌注损伤手术前两小时腹腔注射不同的细胞死亡抑制剂，包括凋亡抑制剂Emricasan、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1、自噬抑制剂3-Methyladenine和坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1，并在缺血45分钟、再灌注24小时后利用TTC/Evans Blue染色评估心肌梗死面积。结果显示，仅有Emricasan和Ferrostatin-1能有效减小梗死面积，且Ferrostatin-1在降低心肌损伤生物标志物方面的效果最为优越，由此证实铁死亡在心肌缺血/再灌注损伤急性期发挥关键作用。

随后，研究者对Ferrostatin-1处理的心肌细胞进行了转录组测序及基因本体论分析，发现脂质相关信号通路显著富集，并确定GPX4是心肌缺血/再灌注损伤相关铁死亡的关键基因。为明确GPX4在心肌中的时空分布，团队利用空间转录组学和空间蛋白质组学技术，分析了已发表的人类心肌梗死组织数据以及小鼠心肌缺血/再灌注损伤模型的组织样本。他们将心肌组织分为缺血区、边界区和正常区进行区域性检测。同时，研究者收集了接受经皮冠状动脉介入治疗的急性心肌梗死患者的血清样本，检测循环GPX4水平，并利用全球急性冠状动脉事件注册评分系统评估其与预后的关联。此外，为确定缺血心肌中GPX4下调的细胞来源，团队对约19192个来自心肌缺血/再灌注损伤小鼠心脏的单细胞进行了单细胞RNA测序，并通过拟时序分析观察GPX4在不同心肌细胞亚群中的动态变化。

在明确GPX4的时空分布和细胞来源后，研究通过构建心肌细胞特异性AAV9载体来实现GPX4的过表达或利用RSL3抑制GPX4功能，分别在体内小鼠心肌缺血/再灌注损伤模型（包括急性期和慢性期）和体外新生大鼠心肌细胞缺氧/复氧模型中，系统评估了心肌细胞来源的GPX4对心肌损伤的保护作用。评估指标包括心肌梗死面积、心肌损伤标志物、TUNEL染色、心脏超声、血清ANP水平、纤维化染色及相关基因表达等。

为探究GPX4调控线粒体功能的分子机制，研究者对过表达GPX4的缺氧/复氧处理心肌细胞进行了转录组测序，发现线粒体相关通路显著变化。随后，他们通过检测氧耗率、ATP水平、线粒体复合物I活性和线粒体膜电位，以及利用透射电子显微镜观察线粒体超微结构，来评估GPX4对线粒体功能的影响。

为寻找GPX4的结合蛋白，研究团队采用免疫共沉淀联合液相色谱-串联质谱技术，鉴定出BNIP3是GPX4的潜在结合伙伴。他们进一步通过一系列免疫共沉淀和表面等离子体共振实验，验证了GPX4与BNIP3的直接相互作用。之后，利用线粒体自噬荧光染色、线粒体蛋白提取和BNIP3小干扰RNA敲低等技术，研究了GPX4对BNIP3依赖性线粒体自噬的促进作用。

为阐明GPX4增加BNIP3蛋白水平的机制，研究者使用蛋白酶体抑制剂MG132和多种自噬抑制剂处理细胞，发现GPX4主要通过抑制泛素-蛋白酶体途径来阻止BNIP3降解。通过泛素化实验，证实GPX4过表达可显著降低BNIP3的泛素化水平。

为寻找参与GPX4-BNIP3相互作用的去泛素化酶，研究者再次利用免疫共沉淀联合液相色谱-串联质谱技术进行筛选，发现去泛素化酶USP20是GPX4-BNIP3复合物的组分。利用CRISPR-Cas9技术构建USP20敲除细胞，通过放线菌酮追踪实验和泛素化实验，证实GPX4稳定BNIP3的效应依赖于USP20。分子动力学模拟和表面等离子体共振实验证明，GPX4能显著增强BNIP3与USP20的相互作用和结合亲和力。

最后，为了确定关键的功能位点，研究者利用AlphaFold3进行结构模拟，发现GPX4的酶活性中心U46位点位于复合物结合界面。通过构建U46A突变体和RSL3处理实验，证实U46是GPX4促进BNIP3-USP20相互作用的关键位点。同时，通过泛素化组学分析筛选并验证了BNIP3蛋白的K131位点是GPX4/USP20系统进行去泛素化调控的关键赖氨酸残基。在体内实验中，研究团队构建了心肌细胞特异性USP20条件性敲除小鼠，通过尾静脉注射AAV9载体实现GPX4的心肌特异性过表达，然后进行急性和慢性心肌缺血/再灌注损伤造模，通过测量心肌梗死面积、心脏功能、纤维化程度等指标，在动物整体水平上验证了USP20对于GPX4介导的心脏保护作用不可或缺。

主要研究结果 研究结果显示，铁死亡是心肌缺血/再灌注损伤急性期的主要细胞死亡方式之一。GPX4在心脏的边界区和正常区高表达，但在缺血区显著降低。这一空间表达模式在人类心肌梗死组织和小鼠心肌缺血/再灌注损伤组织中得到了空间转录组学和空间蛋白质组学数据的一致验证。单细胞测序分析表明，GPX4广泛表达于多种心脏细胞，但在心肌细胞中占比最高，且心肌缺血/再灌注损伤后其表达显著下降。临床数据表明，血清GPX4水平较低的急性心肌梗死患者具有更高的GRACE评分，提示预后不良。

功能实验证实，心肌细胞特异性过表达GPX4能显著减小小鼠心肌梗死面积、降低心肌损伤标志物水平、减少心肌细胞死亡，并在慢性期有效改善心脏功能、减轻心肌纤维化和心室重构。反之，使用RSL3抑制GPX4则加剧上述各项损伤指标。

机制研究发现，GPX4通过其关键的U46活性位点，显著增强了BNIP3与去泛素化酶USP20之间的相互作用。这种增强的相互作用促使USP20更有效地去除BNIP3蛋白K131位点上的泛素链，从而抑制BNIP3通过泛素-蛋白酶体途径降解，提高了BNIP3蛋白的稳定性。稳定后的BNIP3作为线粒体自噬受体，促进了心肌细胞内的线粒体自噬过程，加速了受损线粒体的清除。线粒体自噬水平的提升，最终改善了线粒体功能，表现为ATP水平升高、线粒体复合物I活性增强、线粒体膜电位改善，以及线粒体超微结构（如嵴的完整性）得到保护。在USP20条件性敲除小鼠中，GPX4过表达在急性期失去心脏保护作用，在慢性期其保护效果也大幅削弱，这从整体动物水平证实了USP20在GPX4/BNIP3通路中的核心地位。

结论与研究价值 本研究首次明确了由GPX4、BNIP3和USP20构成的三方复合物在心肌缺血/再灌注损伤中的功能作用，并揭示了一条连接GPX4与铁死亡相关线粒体损伤的新机制。其科学价值在于，它不仅阐释了GPX4作为脂质过氧化物清除剂的经典功能，更发现了一个全新的非酶学功能——作为蛋白相互作用的调控平台，将铁死亡抑制与去泛素化酶介导的线粒体质量控制联系起来。该研究为铁死亡领域的深入研究提供了宝贵的理论见解。在应用价值方面，GPX4/BNIP3/USP20信号轴被确定为缓解心肌缺血/再灌注损伤的潜在治疗靶点，为开发旨在增强GPX4活性或稳定BNIP3的药物或基因疗法提供了新的策略方向。

研究亮点 本研究的主要亮点包括：第一，首次系统描绘了GPX4在心肌缺血/再灌注损伤中的时空分布图谱，并联合人类临床样本数据，增强了研究的转化医学价值。第二，发现了GPX4全新的蛋白质结合与稳定功能，即通过介入泛素-去泛素化系统来调控线粒体自噬，这超越了其经典的抗脂质过氧化作用。第三，鉴定并验证了一个全新的功能性三方复合物GPX4/BNIP3/USP20，并精确解析了其中的关键活性位点（GPX4的U46）和泛素化修饰位点（BNIP3的K131），机制阐述深入且完整。第四，综合运用了空间多组学、单细胞测序、条件性敲除动物模型、分子动力学模拟和表面等离子体共振等前沿技术，实验设计严谨，证据链条完整，为心血管疾病的研究提供了重要的方法学参考。