本文献是一项单细胞RNA测序研究，报告了针对VSIR基因敲除小鼠银屑病模型中皮肤免疫细胞（特别是巨噬细胞）的转录组异质性和功能特征的全面分析。以下是针对该研究的学术报告。
研究作者与机构：本研究主要由中国药科大学江苏省药效研究与评价服务中心的陈昕、蒋经纬、刘婉梅、胡鑫磊、陈文婷、谢晓雪和通讯作者刘军博士合作完成。其中，陈昕、蒋经纬、刘婉梅为共同第一作者。研究单位为中国药科大学江苏省药物筛选重点实验室及南京双子生物科技有限公司。本研究于2020年8月21日在线发表于国际学术期刊《Theranostics》（2020年第10卷第23期）。
研究背景与目的：本研究属于免疫学和皮肤病理学交叉领域，侧重于银屑病的发病机制研究。银屑病是一种常见的自身免疫性皮肤病，其发病涉及遗传、环境和免疫因素等多方面的复杂交互作用。V-domain immunoglobulin suppressor of T cell activation (VISTA)，也称为VSIR，是一种新型的抑制性免疫检查点分子，在维持外周耐受和抑制自身免疫反应中发挥关键作用。先前研究表明，VSIR敲除（VSIR-/-）小鼠会自发产生多器官炎症，并且在咪喹莫特（Imiquimod， IMQ）诱导的银屑病样皮炎模型中，炎症反应会加剧。然而，在VSIR-/-小鼠的银屑病样皮损中，参与炎症的特定免疫细胞亚群及其功能和分子特征尚不清楚。传统的群体细胞分析难以揭示细胞间的异质性。因此，本研究的目的是利用新兴的单细胞RNA测序技术，对野生型和VSIR-/-银屑病样小鼠的皮肤细胞进行无偏倚的高分辨率转录组分析，旨在揭示皮肤免疫细胞（特别是巨噬细胞）的组成、异质性、基因表达特征及其在疾病加重过程中的潜在功能，从而深入理解VISTA在银屑病病理中的作用机制。
详细研究流程：本研究流程严谨，主要包括动物模型建立、样本处理、单细胞测序、生物信息学分析和实验验证等环节。 1. 动物模型建立与诱导：研究使用6-7周龄的雌性C57BL/6J野生型（WT）小鼠和VSIR-/-小鼠（C57BL/6J背景）。连续5天在小鼠背部剃毛区域和右耳局部涂抹5%咪喹莫特乳膏，以诱导银屑病样皮肤炎症。通过测量耳部厚度评估炎症程度，并通过H&E染色进行组织学验证，确认VSIR-/-小鼠炎症更为严重。 2. 皮肤单细胞悬液制备：诱导完成后，将WT和VSIR-/-小鼠的背部皮损组织分别合并处理。组织经剪碎后，使用含有Liberase TM和DNase的RPMI培养基在37°C下消化90分钟。消化后的细胞悬液通过40 μm细胞滤网，获得用于测序的单细胞悬液。 3. 单细胞RNA测序：采用10× Genomics公司的GemCode微流控技术平台进行单细胞捕获、逆转录、文库构建。每个细胞和每个转录本均被赋予唯一的条形码和唯一分子标识符，以确保分析的准确性。文库在Illumina测序平台上进行测序。原始reads使用Cell Ranger软件进行比对，参考基因组为mm10-3.0.0。 4. 生物信息学分析流程：这部分是研究的技术核心。首先进行严格的质量控制，剔除基因表达数量过少（<500）或过多（>4000）、UMI总数过高（>80,000）或线粒体基因比例过高（>10%）的低质量细胞，最终获得23,258个高质量单细胞（WT: 12,040个； VSIR-/-: 11,218个）。随后，使用Seurat R软件包进行数据归一化（Lognormalize方法）、主成分分析、聚类分析和可视化。采用t-分布随机邻域嵌入算法（t-SNE） 在二维空间中展示细胞聚类。通过比较每个细胞簇与其他所有细胞的差异基因表达（标准：p ≤ 0.01且log2倍数变化 ≥ 0.360674），结合PanglaoDB细胞类型数据库，对细胞簇进行注释。进一步分析包括：使用MAST模型进行WT与VSIR-/-组间的差异基因分析；进行基因本体（Gene Ontology， GO）富集分析以探索各细胞类型或状态的功能；使用Monocle 2算法对巨噬细胞和树突状细胞进行拟时序分析，重建细胞分化轨迹；利用10× Genomics的单细胞V(D)J试剂盒对T细胞进行T细胞受体（TCR）分析，评估克隆性。 5. 实验验证：为了验证单细胞测序的发现，研究进行了免疫组织化学分析。对小鼠耳部皮损石蜡切片进行染色，检测巨噬细胞标志物CD68、中性粒细胞标志物Ly6G和T细胞标志物CD3的表达，并进行半定量分析，以确认不同免疫细胞在组织中的浸润程度。
主要研究结果： 1. 皮肤免疫细胞图谱的构建：通过单细胞测序，研究人员成功将来自WT和VSIR-/-银屑病小鼠的23,258个皮肤细胞鉴定为12个主要的细胞类型，包括巨噬细胞（7个亚群）、树突状细胞（DCs，4个亚群）、中性粒细胞、T细胞、成纤维细胞、上皮细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞、肥大细胞、B细胞、肌细胞和脂肪细胞。其中，巨噬细胞是数量最庞大的免疫细胞群体，在WT组中占所有细胞的61.29%，在VSIR-/-组中占77.7%。 2. VSIR缺失导致的免疫细胞组成变化：比较两组细胞比例发现，VSIR-/-小鼠皮肤中树突状细胞、T细胞、成纤维细胞等细胞的比例显著增加。值得注意的是，虽然巨噬细胞总数仍是主体，但其相对比例在VSIR-/-组中有所下降，暗示VISTA缺失可能改变了免疫微环境中不同细胞类型的平衡。 3. 皮肤巨噬细胞的表型和功能异质性：研究人员重点分析了14,243个巨噬细胞，并将其进一步细分为7个具有不同基因表达特征的亚群（Cluster 0-6）。这些亚群表达不同的标志基因，例如Cluster 1高表达干扰素刺激基因（如IFIT1, RSAD2, CXCL10）， Cluster 3高表达主要组织相容性复合体II类分子基因（如H2-Eb1， H2-Aa）， Cluster 4高表达单核细胞相关基因Ly6c2和Vcan。分析发现，这些亚群同时表达M1型（如IL1b， TNF）和M2型（如MRC1）极化标志基因，表明它们在炎症环境中可能具有复杂的功能状态。拟时序分析揭示了这些巨噬细胞亚群之间可能的分化关系。 4. 关键差异表达基因的发现：通过比较VSIR-/-与WT小鼠的巨噬细胞，研究人员发现了一系列显著上调的基因，其中热休克蛋白B1（HSPB1） 和CCAAT/增强子结合蛋白β（CEBPB） 尤为突出。GO富集分析表明，VSIR-/-小鼠来源的巨噬细胞其上调基因功能富集在“蛋白质折叠”和“负向调控细胞凋亡过程”，提示这些细胞可能通过增强抗凋亡能力和蛋白质稳定机制来促进持续炎症。 5. 树突状细胞和成纤维细胞的改变：研究发现VSIR-/-小鼠皮肤中树突状细胞数量增多，且其上调基因功能富集在“细胞因子产生”和“细胞活化”，表明这些细胞处于高度活化状态。成纤维细胞在VSIR-/-小鼠中也出现扩增，并表达一些巨噬细胞相关基因（如Fcer1g, Lyz2），其功能与“炎症反应”和“伤口愈合”相关，提示成纤维细胞与免疫细胞之间存在相互作用，可能参与了银屑病皮损的组织重塑和慢性炎症。 6. T细胞并非主导角色：尽管T细胞在VSIR-/-小鼠中有所增加（占比5.82%，高于WT组的1.27%），但其绝对数量和相对比例远低于巨噬细胞。TCR测序分析显示，两组小鼠中大多数T细胞为独特克隆，仅有约20%的VSIR-/-小鼠T细胞存在克隆扩增，差异不显著。免疫组化结果也显示，皮损中CD68+和Ly6G+细胞（髓系细胞）的浸润远多于CD3+ T细胞。这些证据共同表明，在VSIR-/-小鼠的银屑病模型中，巨噬细胞等髓系免疫细胞可能比T细胞发挥了更为主导的致病作用。 7. 实验验证与测序结果一致：免疫组织化学结果证实了测序数据的可靠性。与WT小鼠相比，VSIR-/-小鼠皮损中CD68+巨噬细胞和Ly6G+中性粒细胞的浸润更多，而CD3+ T细胞的浸润也更多但与髓系细胞相比仍较少，这与单细胞测序揭示的细胞组成变化趋势一致。
结论与价值：本研究的结论是，通过高分辨率的单细胞转录组学分析，首次绘制了VSIR-/-银屑病小鼠皮肤的免疫细胞全景图谱，并深入揭示了皮肤巨噬细胞的表型异质性和独特的基因表达特征。研究发现，VSIR的缺失导致皮肤免疫微环境失衡，表现为巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞等多个细胞群体的比例和功能状态发生改变。研究特别鉴定出HSPB1和CEBPB作为在VSIR-/-小鼠多种免疫细胞中普遍上调的关键基因，它们可能通过调控细胞凋亡、蛋白质稳定和炎症因子产生等机制，共同驱动了更严重的银屑病样炎症。这项研究的科学价值在于，它超越了传统上认为银屑病是“T细胞介导”疾病的观点，强调了巨噬细胞等先天免疫细胞在VISTA调控的银屑病病理中的核心作用。它为理解免疫检查点分子VISTA在皮肤稳态和自身免疫中的功能提供了全新的细胞和分子层面的见解。从应用价值看，该研究鉴定出的巨噬细胞特异性基因标签和关键分子（如HSPB1、CEBPB）可作为潜在的疾病生物标志物或新的治疗靶点，为开发针对银屑病或其他VISTA相关自身免疫性疾病的新型疗法（如靶向特定巨噬细胞亚群）奠定了重要的理论基础和数据资源。
研究亮点：本研究的亮点主要体现在以下几个方面：1. 技术前沿性：率先将单细胞RNA测序技术应用于VISTA缺陷型银屑病小鼠模型，以无偏倚的方式系统解析了皮肤免疫细胞的复杂组成和异质性。2. 发现新颖性：挑战了银屑病中T细胞主导的传统认知，揭示了巨噬细胞在VSIR-/-小鼠模型中的核心地位和高度异质性。3. 关键分子鉴定：成功鉴定出HSPB1和CEBPB这两个在VISTA缺失背景下广泛上调的关键调节分子，为机制研究提供了明确的方向。4. 系统性分析：整合了细胞聚类、差异表达、功能富集、拟时序分析和TCR谱分析等多种生物信息学方法，并结合了组织学验证，构成了一个完整且严谨的研究体系。5. 资源丰富性：所生成的数据集和鉴定的细胞基因特征为后续银屑病和免疫检查点研究提供了宝贵的基础资源。
其他有价值内容：文中提到了所有原始测序数据已上传至NCBI SRA数据库，确保了研究的可重复性和数据可用性。此外，研究得到了中国国家自然科学基金等项目的资助，并感谢了合作公司在测序和生物信息学分析方面的技术支持。这些信息体现了研究的规范性和协作性。