CRISPR技术实时成像动态基因组组织的进展与挑战
本文由Jenna Thuma、Yu-Chieh Chung和Li-Chun Tu*共同完成，作者团队来自美国俄亥俄州立大学生物化学与药理学系、跨学科生物物理学研究生项目、RNA生物学中心以及综合癌症中心。该综述于2023年3月31日发表在《Frontiers in Molecular Biosciences》期刊上，题为“Advances and Challenges in CRISPR-Based Real-Time Imaging of Dynamic Genome Organization”。
本文聚焦于利用CRISPR（规律间隔成簇短回文重复序列）技术实时成像活细胞中动态基因组组织的研究进展与现存挑战。基因组的三维空间结构具有非随机性和动态性，其构象变化直接影响基因转录调控。传统研究方法（如荧光原位杂交FISH和染色体构象捕获技术）依赖固定细胞，可能引入实验假象，而CRISPR技术的出现为活细胞基因组动态观测提供了革命性工具。
CRISPR系统通过失活Cas9蛋白的核酸酶活性（如D10A和H840A突变）转化为dCas9（无切割活性的Cas9），使其仅保留DNA结合能力。该系统包含crRNA（CRISPR RNA）、tracrRNA（反式激活crRNA）、Cas蛋白和PAM（原间隔序列邻近基序）四个关键元件。通过融合crRNA与tracrRNA形成sgRNA（单链引导RNA），可简化操作流程（Chen et al., 2013）。
支持证据：
- dCas9-GFP首次用于标记重复基因组序列（如端粒），非重复序列需通过多sgRNA混合物（26–72条）实现信号放大（Chen et al., 2013）。
- 多色成像通过正交CRISPR-dCas9变体（如SpCas9、NmCas9和St1Cas9）实现三色标记（Ma et al., 2015）。
为提升低重复/非重复序列的成像效率，研究者开发了多种信号放大方法：
- CRISPRainbow：通过sgRNA支架插入MS2、PP7和BoxB RNA发夹结构，结合不同荧光蛋白实现七色成像，但仅适用于高重复序列（>100拷贝）（Ma et al., 2016a）。
- CRISPR-SunTag：将24×GCN4肽段与dCas9融合，招募scfv抗体-荧光蛋白复合物，信噪比提升3倍（Ye et al., 2017）。
- CRISPR-Casilio：通过sgRNA的Pumilio结合位点（PBS）阵列招募荧光效应蛋白，可标记非重复序列（Clow et al., 2022）。
局限性：
- CRISPRainbow仅适用于人类基因组中约30个高重复位点。
- CRISPR-Casilio早期版本存在非特异性信号问题，需优化PBS设计（Hong et al., 2018）。
CRISPR成像技术揭示了基因组位点运动的异质性：
- 细胞周期依赖性：早期G1期染色质压缩更紧密，后期G1期松弛（Chung et al., 2023）。
- 转录调控关联：转录抑制剂DRB可提升活跃基因位点（如ZNF358）的移动性，但对沉默基因（如CYP4F12）无影响（Ku et al., 2022）。
- 染色体域动态：多色标记显示染色体域构象可在表观修饰调控下动态切换（Feng et al., 2020）。
技术验证：
- 单核小体追踪和LacO插入实验均支持染色质动态性与功能状态相关（Nozaki et al., 2017）。
当前CRISPR成像的局限性包括：
- 细胞类型依赖性：sgRNA标记效率需针对不同细胞类型优化。
- 高灵敏度需求：非重复序列成像需低噪声显微镜系统。
- 高通量瓶颈：现有技术难以规模化应用。
潜在解决方案：
- 开发新型荧光标记策略（如URIL-FBPNA探针）（Liang et al., 2022）。
- 结合Cas13系统实现DNA与RNA同步成像（Sun et al., 2020）。
本文系统总结了CRISPR实时成像技术的进展，强调了其在解析基因组时空动态中的不可替代性：
1. 科学价值：为染色质动态与基因调控关系提供了直接证据，挑战了“染色体构象静态”的传统假设。
2. 技术革新：多色成像、信号放大等策略推动了活细胞基因组研究的精度边界。
3. 应用潜力：未来或可应用于疾病相关单核苷酸变异（SNV）的实时检测（如CasPLA技术）（Zhang et al., 2018）。
本文为基因组动态研究提供了技术路线图，并指明了未来优化方向，是领域内的重要参考文献。