本研究由中国医科大学口腔医学院的李玉超博士在潘亚萍教授指导下完成，并于2024年3月完成博士学位论文。该研究聚焦牙周炎发病机制，探索了牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis）通过调控宿主细胞糖酵解代谢加重牙周炎症的新机制。

学术背景

牙周炎是全球范围内危害口腔健康的主要疾病，我国成人患病率高达90%。近年研究发现，牙周炎与心血管疾病、糖尿病等全身系统性疾病密切相关。牙龈卟啉单胞菌作为牙周炎关键致病菌，可通过慢性感染改变宿主上皮细胞生物学行为。1921年Otto Warburg提出的”瓦氏效应”指出，肿瘤细胞在富氧条件下仍依赖糖酵解供能。类似地，炎症微环境中的细胞也表现出糖酵解增强的特征。研究表明，牙周炎发展伴随显著代谢重编程，但P. gingivalis是否通过调控口腔上皮细胞糖酵解影响牙周炎进展尚不明确。

单羧酸转运蛋白4（Monocarboxylate transporter 4, MCT4）是乳酸转运关键蛋白，其膜定位对维持糖酵解稳态至关重要。跨膜EMP24结构域蛋白10（Transmembrane EMP24 domain-containing protein 10, TMED10）作为分泌蛋白受体，可调控炎症因子运输。本研究首次发现P. gingivalis感染通过TMED10促进MCT4膜定位，进而增强糖酵解并加重炎症的分子机制。

研究流程与方法

第一部分：临床与动物模型验证

1. 临床样本分析：

   • 收集3例健康者和3例IV期牙周炎患者牙龈组织进行TMT蛋白质组学测序
   • 筛选2013个差异蛋白（P<0.05，FC>1.2或<0.83）
   • 扩大样本量（健康30例/牙周炎29例）进行免疫组化验证
   • 采用SPSS 24.0进行统计分析，GraphPad Prism 8.0作图

2. 动物模型构建：

   • C57BL/6小鼠左上颌第一磨牙结扎联合P. gingivalis涂抹（1×10⁹ CFU/ml，每2天1次，持续4周）
   • Micro-CT检测牙槽骨吸收，H&E染色验证炎症程度
   • 免疫组化检测牙龈上皮MCT4、CD147等糖酵解蛋白表达

第二部分：细胞机制研究

1. 细胞模型建立：

   • 构建P. gingivalis长期感染（MOI=1）人永生化口腔上皮细胞（HIOECs）和牙龈上皮细胞（Epi4）模型
   • 检测指标：
     • 炎症因子：ELISA检测IL-1β、IL-6分泌，qRT-PCR和Western blot检测表达水平
     • 糖酵解活性：Seahorse检测细胞外酸化率（ECAR），LDH活性测定
     • 代谢物检测：葡萄糖消耗量、乳酸生成量

2. 功能验证实验：

   • 免疫荧光和膜浆分离Western blot检测MCT4亚细胞定位
   • 构建MCT4稳定沉默细胞系（RNA干扰慢病毒）
   • 糖酵解抑制剂2-DG处理验证代谢与炎症的因果关系

第三部分：分子机制解析

1. TMED10功能研究：

   • 临床组织和动物模型免疫组化验证TMED10表达
   • 构建TMED10沉默细胞系，检测糖酵解和炎症指标变化
   • 分子对接预测（AutoDock Vina）和免疫共沉淀验证TMED10-MCT4相互作用
   • 共定位分析：免疫荧光检测R值>0.75

2. 调控关系验证：

   • 检测TMED10沉默后MCT4 mRNA和蛋白表达变化
   • 免疫荧光定量分析MCT4膜定位改变
   • 反向验证MCT4沉默对TMED10表达的影响

主要研究结果

1. 临床发现：

   • 蛋白质组学显示牙周炎组MCT4表达显著上调（FC=1.929）
   • 免疫组化验证MCT4、CD147等糖酵解蛋白在牙周炎组织中高表达（P<0.05）
   • MCT4表达水平与牙周炎分期呈正相关（P<0.01）

2. 动物实验：

   • 成功建立牙周炎小鼠模型（Micro-CT显示牙槽骨吸收>50%）
   • 模型组牙龈上皮MCT4表达较对照组升高2.3倍（P<0.05）

3. 细胞实验：

   • P. gingivalis感染4周后：
     • 葡萄糖消耗增加1.8倍，乳酸分泌增加2.1倍（P<0.01）
     • IL-1β分泌量增加3.2倍（P<0.01）
     • MCT4膜定位比例从25%升至68%（P<0.05）
   • 沉默MCT4使乳酸分泌减少42%（P<0.01），IL-6下降51%（P<0.01）

4. 机制解析：

   • TMED10在牙周炎组表达上调（FC=2.642，P<0.01）
   • 免疫共沉淀证实TMED10与MCT4存在直接相互作用
   • 沉默TMED10使MCT4膜定位降低57%（P<0.01），糖酵解速率下降39%

结论与价值

本研究首次揭示： 1. 科学发现：P. gingivalis通过上调TMED10促进MCT4膜定位，增强口腔上皮细胞糖酵解，形成促炎微环境。 2. 临床意义：为牙周炎治疗提供新靶点，TMED10-MCT4轴可能成为干预牙周炎及相关全身疾病的新策略。 3. 理论创新：提出”病原菌-代谢重编程-炎症放大”的牙周炎发展新机制。

研究亮点

1. 首次建立P. gingivalis长期小剂量感染细胞模型（MOI=1，持续4周）
2. 创新性发现TMED10调控MCT4膜定位的新功能
3. 多维度验证：临床样本-动物模型-细胞实验-分子机制
4. 国家自然科学基金面上项目（No. 82170969）支持

该研究为理解牙周炎与全身疾病的关联提供了代谢视角，开发的慢病毒沉默体系为后续研究奠定技术基础。未来可进一步探索靶向TMED10的小分子抑制剂在牙周炎治疗中的应用潜力。