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这篇研究由Jun Li、Panzhu Yao、Ke Tang、Xuyang Zhao、Xiyang Liu、Qinguo Liu、Tongxuan Wei、Hong Xuan、Siqi Bian、Ying Guo*、Zhenjun Yang*、Zhi-Qi Zhang*和Liqin Zhang*合作完成，研究机构包括北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室、中国医学科学院北京协和医学院药物研究所新药作用机制研究与药效评价北京市重点实验室以及陕西师范大学化学化工学院生命分析化学陕西省重点实验室。研究成果于2024年8月21日发表于《Journal of the American Chemical Society》（JACS），标题为《Functional Aptamers In Vitro Evolution for Intranuclear Blockage of RNA-Protein Interaction》。

学术背景 该研究属于核酸药物开发与化学生物学交叉领域。过去30年，适配体（aptamer）作为”化学抗体”在药物开发中被寄予厚望，但迄今FDA仅批准两种适配体药物。传统适配体开发面临两大瓶颈：1）常规SELEX（指数富集的配体系统进化）技术需经历多轮亲和筛选与功能验证的分离流程，耗时长且候选分子受限；2）由4种标准核苷酸组成的适配体化学多样性不足，需后续修饰但会削弱结合活性。此外，现有适配体药物主要靶向分泌型或膜蛋白，难以作用于细胞内靶点。

针对这些问题，研究团队提出创新性解决方案——功能适配体体外进化平台（FAIVE）。该平台将亲和分子获取与功能筛选整合，同时在筛选过程中引入化学多样性，旨在快速获得能结合靶蛋白并调控其功能的适配体。研究以HIV-1 Tat蛋白与TAR RNA的核内相互作用为模型，验证FAIVE平台在开发靶向核酸-蛋白质相互作用的治疗性适配体方面的潜力。

详细工作流程 1. FAIVE平台构建： - 采用”粒子展示”（particle display）技术与点击化学策略构建初始库。库设计包含25个随机化区域（其中dT被5-乙炔基修饰的dU取代）和21bp引物结合位点。 - 通过乳液PCR将单链适配体转化为颗粒展示库，每个颗粒表面呈现单克隆核酸序列。 - 使用点击化学将吲哚衍生物（色氨酸侧链模拟物）引入文库，增加疏水性。研究发现修饰后的库能提高筛选成功率。

1. 靶标设计与筛选：

   • 选用HIV-1 Tat14肽段（残基48-61）和TAR39 RNA（HIV mRNA 12-50位）作为靶标。
   • 开发创新的功能筛选策略：将TAR RNA与Tat肽段分别标记荧光团（TAMRA）和淬灭基团（BHQ-2），当两者结合时荧光淬灭。适配体若能破坏该相互作用，则恢复荧光信号。
   • 使用流式细胞分选（FACS）筛选荧光阳性颗粒，经过多轮迭代获得功能性适配体。与传统SELEX相比，FAIVE将筛选周期从7-20轮缩短至4轮。

2. 适配体表征：

   • 通过生物层干涉仪（BLI）测定亲和力，最优TAR RNA适配体的解离常数（Kd）达9 nM。
   • 建立竞争性置换实验评估阻断效果，FAIVE获得的适配体在200-400 nM浓度下即可抑制50%的Tat-TAR相互作用，显著优于互补DNA（IC50>1 μM）。

3. 递送系统开发：

   • 设计H型阳离子脂质CLD（二油酰基-3,3’-二硫代双[2-(2,6-二氨基己酰胺)]丙酸酯）与中性胞苷脂质DNCA组成的纳米递送系统。
   • 优化配方CLD:DNCA:适配体=2:1（摩尔比），粒径166 nm，PDI 0.66，Zeta电位-6.8 mV。
   • 机制研究表明该脂质体通过巨胞饮作用和小窝蛋白介导的内吞进入细胞，6小时后入核。

4. 功能验证：

   • 建立双荧光素酶报告系统：将pHIV-1-LTR-Luc（萤火虫荧光素酶）、pCEP4-Tat（Tat基因）和pRL-TK（海肾荧光素酶内参）共转染293T细胞。
   • FAIVE适配体（400 nM）可抑制70%的Tat介导的转录激活，显著优于传统SELEX获得的适配体（30-40%抑制率）。
   • 在VSVG/HIV-1假病毒感染模型中，适配体能降低40%的病毒转录活性，证明其核内阻断效果。

主要结果 1. FAIVE平台成功筛选出针对Tat蛋白和TAR RNA的高效适配体。其中Tat靶向适配体的Kd达nM级，TAR RNA适配体展现出优于既往报道的抑制活性（IC50 200-400 nM vs 文献值400 nM）。

1. 结构分析表明，高效适配体并非通过序列互补性结合TAR RNA，而是依赖空间结构匹配，这与互补DNA的抑制效果差异（cDNA亲和力最高但功能最弱）形成鲜明对比。

2. 脂质体递送研究实现三个突破：1）核内递送效率提升；2）通过降低阳离子脂质比例减少毒性；3）半衰期延长至11小时（裸适配体仅数分钟）。

3. 细胞实验证实适配体需进入细胞核才能发挥作用，这与HIV-1 Tat-TAR相互作用发生在核内的生物学特性一致，也验证了递送系统的有效性。

结论与价值 该研究建立了首个整合亲和筛选与功能验证的适配体开发平台FAIVE，其创新性体现在： 1. 方法学突破：通过荧光信号可视化” displacement”过程，FACS单颗粒分选大幅提高筛选效率（>1000倍通量）。 2. 化学修饰策略：在筛选初期引入非天然核苷酸（乙炔基dU），通过点击化学构建多样化文库。 3. 靶标范围扩展：首次实现针对核内RNA-蛋白质相互作用的适配体开发。

科学价值方面：1）为研究核酸-蛋白相互作用提供新工具；2）开辟适配体药物开发新范式。应用价值：1）针对HIV的潜在治疗策略；2）平台可推广至其他难成药靶点。研究者特别指出，FAIVE可克服传统SELEX的”黑箱”缺陷，通过功能导向筛选直接获得治疗活性分子。

亮点与创新 1. 首创功能适配体”一步式”筛选平台，将开发周期从数月缩短至数周。 2. 解析适配体结构与功能关系，证明空间阻碍比序列互补更重要。 3. 开发能穿透核膜的脂质体，突破核酸药物递送瓶颈。 4. 在假病毒模型中验证生物学效果，为后续动物实验奠定基础。

值得关注的是，研究者发现适配体亲和力与抑制效果并非线性相关，说明传统基于亲和力的筛选策略存在局限。此外，FAIVE平台可兼容多种化学修饰，为开发更稳定的治疗性适配体提供可能。这些发现对核酸药物设计具有普遍指导意义。