CRISPR/Cas9系统：细菌适应性免疫中的双RNA引导DNA内切酶机制及其基因编辑应用
作者及发表信息
本研究由Martin Jinek（美国加州大学伯克利分校霍华德·休斯医学研究所）、Krzysztof Chylinski（奥地利维也纳大学）、Emmanuelle Charpentier（瑞典于默奥大学）等团队合作完成，于2012年8月17日发表在《Science》期刊上。通讯作者为Jennifer A. Doudna和Emmanuelle Charpentier。
学术背景
CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas（CRISPR相关蛋白）系统是细菌和古菌中对抗病毒和质粒的适应性免疫机制。此前研究已知，CRISPR系统通过小RNA（crRNA）引导Cas蛋白识别并沉默外来核酸，但II型系统的具体分子机制尚不明确。本研究旨在揭示II型CRISPR/Cas系统中Cas9蛋白的DNA切割机制，并探索其作为可编程基因编辑工具的潜力。研究目标包括：（1）解析Cas9在双RNA（tracrRNA:crrNA）引导下的DNA切割特性；（2）阐明Cas9的核酸酶结构域功能；（3）开发单链嵌合RNA（sgRNA）简化系统。
研究流程与实验设计
1. Cas9的DNA切割机制验证
- 研究对象：化脓链球菌（*Streptococcus pyogenes*）的Cas9蛋白、42nt crRNA和75nt tracrRNA。
- 实验方法：
- 通过体外过表达纯化Cas9蛋白（图S2），测试其对含互补序列的质粒DNA和寡核苷酸双链的切割活性（图1a-b）。
- 使用电泳迁移实验（EMSA）验证tracrRNA对Cas9-DNA结合的促进作用（图S9）。
- 关键发现：
- 单独crRNA无法引导Cas9切割，需tracrRNA形成双RNA结构才能激活切割（图1a）。
- 切割位点位于PAM（原间隔序列邻近基序，protospacer adjacent motif）上游3bp处，产生平末端（图1c-e）。
Cas9核酸酶结构域功能解析
双RNA的最小功能单元与种子序列
PAM序列的作用机制
单链嵌合RNA（sgRNA）开发
主要结果与逻辑关联
- 双RNA引导机制：tracrRNA通过稳定crRNA-Cas9复合物激活切割（图1a→图S9）。
- 结构域分工：HNH和RuvC-like域分别切割互补链和非互补链（图2→图S8），解释了双链断裂（DSB）生成机制。
- PAM依赖性：PAM识别是靶DNA解链和R环形成的许可信号（图4→图S13），为后续基因编辑的靶点设计提供规则。
- sgRNA可行性：嵌合RNA简化系统（图5）为后续基因编辑工具开发奠定基础。
结论与价值
1. 科学价值：首次阐明II型CRISPR/Cas系统中Cas9的双RNA引导机制及PAM依赖性，填补了细菌适应性免疫的分子机制空白。
2. 应用价值：
- 提出sgRNA设计范式，推动CRISPR/Cas9成为可编程基因组编辑工具。
- 为锌指核酸酶（ZFNs）和TALENs提供了更高效的替代方案。
研究亮点
1. 机制创新：揭示Cas9的双RNA激活机制及双结构域协同切割模式。
2. 技术突破：开发sgRNA系统，实现“单RNA编程”基因编辑。
3. 跨物种适用性：通过正交实验验证Cas9的物种特异性（图S11），提示共进化关系。
其他重要内容
- 专利布局：作者团队已就相关技术提交专利申请，体现其转化潜力。
- 争议点：PAM在非互补链的关键作用（与I型系统不同）引发后续对Cas9-DNA互作的结构研究需求。
（注：全文引用图表及补充材料均来自原文献，数据细节可参考原文图S1-S15及附表。）