本研究由深圳龙岗中心医院/汕头大学医学院龙岗临床研究院的罗勇、刘艺彪，深圳大学合成生物学研究中心/高等研究院及健康科学中心生物医学工程学院的刘星云、徐太林、张雪君共同完成。研究论文题为“通过涌现宏观定向聚集增强临床样本中痕量Tau蛋白的生物传感”，发表于Elsevier旗下的学术期刊《Biosensors and Bioelectronics》第273卷（2025年），文章识别号为117157，已于2025年1月17日在线发表。
此项研究属于生物传感与生物医学工程交叉领域，具体聚焦于阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease， AD）的早期筛查技术。研究的学术背景源于AD作为一种不可逆的神经退行性疾病，对全球老龄化人口构成了日益严重的健康威胁。目前，临床上诊断AD的金标准依赖于对脑脊液（Cerebrospinal Fluid, CSF）中生物标志物（如磷酸化Tau蛋白）的定量检测。然而，脑脊液采集具有侵入性、操作复杂且成本高昂，难以适用于大规模人群的早期筛查。相比之下，血液样本获取便捷、创伤小，是理想的大规模筛查介质。但血液中源自大脑的AD相关蛋白（如Tau蛋白）浓度极低，处于痕量水平，远低于传统检测方法的灵敏度下限。此外，与DNA/RNA可通过聚合酶链式反应（PCR）等扩增不同，蛋白质由于其结构复杂稳定，无法进行类似的分子扩增，这给基于血液的痕量蛋白生物传感带来了巨大挑战。因此，开发一种高灵敏度、高特异性、低成本且易于操作的检测平台，用于血液中痕量AD生物标志物的检测，具有迫切而重要的临床意义。本研究旨在应对这一挑战，目标是通过创新方法增强对临床血清样本中痕量Tau蛋白的检测能力，为AD的早期筛查提供一种潜在的新工具。
本研究提出并验证了一种名为“声学诱导涌现宏观定向聚集”的创新策略。其详细工作流程可概括为以下几个核心环节：
首先，是功能化微球的制备。研究以表面修饰有羧基的微球（直径选择为5微米，以平衡声学响应和荧光承载能力）作为生物传感的载体。通过酰胺键形成反应，将链霉亲和素（Streptavidin）共价连接到微球表面。随后，利用链霉亲和素与生物素之间强力的非共价相互作用，将生物素化的Tau蛋白捕获抗体固定在微球上。经过洗涤去除未结合的抗体后，功能化微球被悬浮在磷酸盐缓冲液中，于4℃避光保存备用。这一步骤为后续特异性捕获目标蛋白奠定了基础。
其次，是检测体系的构建与声学聚集过程。在实际检测时，将待测血清样本（或用于构建标准曲线的含不同浓度Tau蛋白的50%人血清模拟样本）与上述功能化微球以及荧光标记的Tau检测抗体混合孵育。若样本中存在Tau蛋白，则会与微球上的捕获抗体结合，并被检测抗体识别，形成一个“微球-捕获抗体-Tau蛋白-荧光检测抗体”的“三明治”复合物，从而在微球上标记了荧光信号。随后，将混合液注入一个特制的环形声学共振腔中并密封。
研究的关键创新环节在于一个定制化的声学驱动与富集平台。该平台集成了高频（约620 kHz）超声发生装置、驱动电路控制单元（包括频率电压调制、驱动控制、低通滤波和电源管理）以及多层设计的微型共振腔。当启动超声场后，声波在共振腔内形成特定的声压分布，产生声辐射力。根据理论模拟与计算（基于声势函数和微球与流体介质的压缩系数、密度对比等参数），功能化微球在非均匀的声场中会受到一阶声辐射力的驱动，沿着声压梯度向声压节点（即声压最小点）迁移。同时，随着微球彼此靠近，它们之间相互作用产生的二阶辐射力会进一步增强相互吸引。在声辐射力和声流引发的斯托克斯拖曳力的共同作用下，原本随机分布的微球被快速、定向地驱动至共振腔中心的压力节点处，在短时间内（约10秒内）聚集形成一个肉眼可见的稳定聚集体。这一过程被称为“宏观定向聚集”。
第三，是信号采集与定量分析。微球的聚集带来了显著的信号增强效应。一方面，负载有荧光分子的微球在压力节点处的局部浓度急剧增加；另一方面，聚集微球之间的光散射效应可能促进了激发光的吸收。因此，相较于分散状态，聚集状态下的荧光信号被大幅放大。研究人员使用荧光显微镜对聚集位点进行成像，并采集其荧光强度信号。通过分析荧光强度与已知浓度Tau蛋白标准品对数浓度之间的对应关系，建立标准曲线，从而实现对未知样本中Tau蛋白浓度的定量检测。整个工作流程的数据分析主要依赖于对荧光图像强度的量化统计，并计算检测限（Limit of Detection， LOD）、线性范围、相对标准偏差（Relative Standard Deviation， RSD）等分析性能参数，以及使用接收者操作特征曲线（Receiver Operating Characteristic Curve, ROC曲线）评估临床诊断效能。
本研究取得了一系列系统而深入的结果，这些结果环环相扣，共同支撑了最终的研究结论。
在平台构建与表征方面，研究通过数值模拟（COMSOL Multiphysics软件）展示了在620 kHz频率下，共振腔内形成了清晰的声压聚焦节点，声辐射力的分布模拟结果与设计预期吻合。实验观察证实，功能化微球能在约10秒内快速聚集形成稳定组装体，且在不同生物流体（如PBS、血清等）中的聚集时间无显著差异，证明了该方法的鲁棒性。通过优化，确定微球的最佳使用浓度为2.5 mg/ml，此时聚集组装体的荧光信号在约9秒后达到稳定，为后续痕量蛋白检测选定了最优参数。
在分析性能验证方面，结果令人印象深刻。研究证明，应用声学聚集策略后，目标蛋白的荧光信号强度比未应用声波时的分散状态增强了约6.97倍，直观展示了该方法强大的信号富集能力。通过对一系列浓度梯度的Tau蛋白标准品进行检测，建立了从1 pg/mL到10 ng/mL的宽线性检测范围。根据信噪比（S/N=3）计算出的检测限低至0.183 pg/mL。这一灵敏度满足了在血液中检测极低浓度Tau蛋白的要求。方法的重现性良好，对同一浓度样本进行13次重复检测，荧光强度的相对标准偏差仅为3.02%。特异性实验表明，在存在其他非靶向蛋白（如BSA、IgG等）时，聚集体的荧光信号与空白对照无显著差异，而只有在Tau蛋白存在时才会产生强荧光信号，证实了该方法的高特异性。
在临床应用验证方面，研究结果具有明确的转化价值。研究人员利用该策略检测了临床收集的样本，包括14名AD患者和19名健康对照者的血浆。检测结果显示，AD患者组的血浆Tau蛋白平均浓度估计值是健康对照组的1.50倍，两组间存在极显著的统计学差异（p < 0.001）。尽管存在个体差异，部分患者与健康人的水平有所重叠，但该策略整体展现出了出色的区分能力。通过绘制ROC曲线进行评估，以Tau蛋白为生物标志物，该声学诱导策略区分AD患者与健康对照的准确度达到90.9%，曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）值超过0.928，表明其具有优秀的诊断判别能力。此外，研究还估算了单次检测的成本约为2.96美元，突出了该方法低成本的优势。
本研究的结论是，成功开发并验证了一种基于声学诱导宏观定向聚集的生物传感新策略，用于高灵敏、高特异、低成本地检测临床血液样本中的痕量Tau蛋白，并在区分AD患者与健康个体方面表现出巨大潜力。这项工作为解决AD早期筛查中血液生物标志物检测灵敏度不足的瓶颈问题提供了创新性的技术方案。
该研究的价值体现在多个层面。在科学价值上，它创造性地将声学操控技术与免疫荧光生物传感相结合，通过物理富集（声学聚集）而非化学/生物扩增的方式，实现了对无法扩增的蛋白质生物标志物的信号放大，为痕量蛋白检测领域提供了一种全新的思路和技术路径。在应用价值上，该方法具有检测灵敏度极高、成本低廉、操作相对简便（无需复杂样本前处理或扩增步骤）、检测快速（数分钟内完成）以及设备可便携化等优点，有望发展成为适用于社区医院或体检中心的大规模AD早期筛查工具，对推动AD的早期发现和干预具有重要的社会意义。
本研究的亮点突出。第一， 方法学的创新性：“涌现宏观定向聚集”策略是其核心创新，通过定制声学共振腔和驱动系统，主动操控功能化微球进行定向聚集，实现了对目标蛋白的物理捕获与空间富集，从而大幅提升检测信号。第二， 卓越的分析性能：达到了0.183 pg/mL的超低检测限和1 pg/mL至10 ng/mL的宽线性范围，性能优于许多已报道的生物传感平台。第三， 明确的临床验证：研究并未停留在标准品检测阶段，而是利用真实临床样本进行了验证，获得了高达90.9%的区分准确度，证明了其临床应用的可行性。第四， 成本与便捷性优势：低廉的单次检测成本和简化的流程设计，使其更符合早期筛查对可及性和可负担性的要求。第五， 技术的可扩展性：作者在结论中指出，未来可基于此策略开发针对Aβ42、Aβ40、神经丝轻链（NfL）等多种AD生物标志物的多重检测平台，以进一步提高诊断的特异性和敏感性，展示了该技术平台的延展潜力。
这项研究是一项从方法创新、性能验证到临床初步应用均完成度较高的优秀工作，为AD及其他疾病的痕量蛋白生物标志物检测领域贡献了一个兼具前沿性与实用性的新方案。