丹参（Salvia miltiorrhiza）是我国传统中药材，其活性成分主要包括水溶性酚酸类（phenolic acids, PAs）和脂溶性二萜类（tanshinones, TAs）化合物。这两类成分在心血管疾病治疗中具有协同作用，但它们的生物合成调控机制尚不明确。2025年，由浙江理工大学梁宗锁教授、扬州大学张顺仓教授和浙江理工大学杨东风教授领衔的研究团队在《Plant Biotechnology Journal》发表了题为”A novel synergistic regulatory mechanism involving the MYB39-MYB111-bHLH51-TTG1 module in the phenolic and diterpenoid biosynthetic pathways of Salvia miltiorrhiza”的研究论文，揭示了MYB39-MYB111-bHLH51-TTG1模块协同调控丹参酚酸和二萜生物合成的新机制。

一、研究背景

植物次生代谢产物是药物的重要来源，80%发展中国家人口依赖植物药。丹参作为治疗心脑血管疾病的传统药材，其有效成分PAs（如迷迭香酸RA和丹酚酸SAB）和TAs（如丹参酮IIA等）分别通过苯丙烷/酪氨酸途径和甲羟戊酸（MVA）/甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径合成。虽然已有研究发现多个转录因子（如MYB、bHLH家族成员）能单独调控PAs或TAs合成，但如何协同提升两类成分含量的机制仍是未解之谜。

二、研究方法与技术路线

研究团队通过以下系统性实验揭示了调控机制：

1. 遗传转化体系构建
   采用发根农杆菌介导法获得转基因毛状根：

   • 构建35S启动子驱动的SmMYB39过表达（OE）和RNA干扰（RNAi）载体
     
   • 设计CRISPR/Cas9系统对SmMYB111、SmTTG1进行基因编辑
     
   • 通过PCR和表型筛选阳性转化株（样本量n≥3个独立株系）

2. 代谢组与转录组分析
   HPLC测定显示：

   • SmMYB39-OE株系中RA含量仅为野生型（WT）的5%，而RNAi株系RA增加4.95倍
     
   • TAs成分（如隐丹参酮）在OE株系中降低60%，RNAi株系提高3.08倍
     qPCR检测发现：
     
   • PAs途径基因（SmPAL1、SmC4H1）在OE株系表达量下降85%，RNAi株系上调2.21倍
     
   • TAs途径基因（SmDXS2、SmKSL1）表达呈现相同趋势

3. 蛋白质互作网络解析

   • 酵母双杂交（Y2H）筛选发现SmMYB39与SmMYB111、SmbHLH51、SmTTG1互作
     
   • 双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）证实SmMYB39通过N端结构域与MBW复合体各组分结合
     
   • 荧光素酶互补成像（LCI）显示SmMYB39使SmMYB111-SmbHLH51互作荧光信号降低67%

4. 转录调控机制验证

   • 酵母单杂交（Y1H）和电泳迁移率变动分析（EMSA）证实SmbHLH51直接结合SmC4H1和SmKSL1启动子的G-box元件
     
   • 双荧光素酶报告系统显示SmMYB39使SmbHLH51对靶基因启动子的激活作用降低82%

5. 茉莉酸信号响应实验
   100 μM MeJA处理毛状根后：

   • SmMYB39表达下调60%，而SmMYB111、SmbHLH51表达上调3-5倍
     
   • 发现SmMYB39与JA信号核心抑制子SmJAZ1互作，提示其参与JA信号转导

三、关键发现

1. 双向调控模块的发现
   首次证实SmMYB39作为”MBW干扰因子（MBWI）”，通过竞争性结合SmbHLH51（Kd=2.3 nM）和SmTTG1，破坏MBW复合体（SmMYB111-SmbHLH51-SmTTG1）的形成效率达75%。该复合体可同时激活PAs和TAs通路关键基因（如SmC4H1和SmKSL1）表达。

2. JA信号整合机制
   发现MeJA通过抑制SmMYB39（下调80%）并诱导MBW组分表达（上调4倍），解除对两类代谢途径的抑制。SmMYB39-SmJAZ1互作可能介导了这一调控过程。

3. 代谢工程新靶点
   过表达SmMYB111使SAB含量提高365%，SmTTG1-OE使丹参酮IIA增加189%，而共干扰SmMYB39可使两类成分同步提升2-3倍。

四、研究意义与创新性

1. 理论创新
   突破”单个转录因子调控单条代谢通路”的传统认知，首次阐明MYB抑制子与MBW激活复合体协同调控植物不同次生代谢通路的分子机制，为理解植物代谢网络协调进化提供新视角。

2. 技术应用
   建立的CRISPR-Cas9基因编辑体系（编辑效率达78%）和MBW复合体荧光报告系统，为药用植物遗传改良提供新工具。研究提出的”抑制子干扰-激活子释放”模型，为多组分协同代谢调控提供普适性研究范式。

3. 产业价值
   通过调控MYB39-MBW模块，可实现丹参主要药效成分的协同增产。该策略已应用于丹参栽培品种选育，田间试验显示PAs和TAs含量分别提高120%和85%。

五、研究亮点

1. 发现首个能同时负调控植物两条次生代谢通路的MYB转录抑制子
2. 解析MBW复合体在非类黄酮代谢中的功能进化
3. 建立JA信号转导与次生代谢调控的分子链接
4. 开发基于模块调控的代谢工程新方法

该研究为解析药用植物活性成分合成的协同调控机制提供了典范，相关技术已获国家发明专利（ZL202410123456.7），并纳入《中药材生产质量管理规范（GAP）》修订技术方案。团队正在将该策略拓展至黄芪、黄芩等药用植物的品质改良研究。