本文属于类型a，是一篇原创研究论文。以下是对该研究的学术报告。

本研究由Firaol S. Midekssa、Christopher D. Davidson、Brendon M. Baker等来自美国密歇根大学（University of Michigan）生物医学工程系、心血管内科、细胞与分子生物学项目以及妇产科的研究人员共同完成，发表于*Bioactive Materials*期刊第49卷（2025年），页码652–669。

一、研究背景与目的

组织工程与再生医学的一个核心目标是构建能够恢复或改善受损组织功能的生物移植物。然而，对于较厚或代谢活跃的组织（如肝脏、心脏、肾脏），由于氧气和营养物质扩散的限制（通常为100–200微米），内部细胞极易坏死。预先在工程组织中构建微血管网络（prevascularization）被认为是解决这一难题的关键策略。当前的自下而上（bottom-up）血管化策略通常依赖于血管生成性组装（vasculogenic assembly），即内皮细胞（endothelial cells, ECs）在三维基质中自组装形成毛细血管网络。然而，传统方法通常需要将间充质支持细胞（如成纤维细胞、周细胞）与内皮细胞共培养，以促进网络形成和稳定，尤其是在高密度、力学性能较好的水凝胶中。支持细胞的引入带来了诸多问题：不可控的增殖、过度收缩导致的组织压实和血管网络破坏、实验体系复杂性增加以及细胞治疗成本的上升。因此，作者试图开发一种无需支持细胞、仅通过材料本身特性即可促进内皮细胞血管生成性组装的新策略。该研究的核心假设是：在致密纤维蛋白（fibrin）水凝胶中嵌入合成基质纤维，可以提供类似于支持细胞所提供的机械信号，从而取代支持细胞的功能。

二、研究流程与方法

研究分为体外实验和体内实验两大部分，共包含多个相互关联的环节。

1. 材料制备与表征： 研究首先合成了乙烯砜基团功能化的葡聚糖（dextran vinyl sulfone, DexVS），并通过静电纺丝技术制备了平均直径1.5微米、平均长度72微米的DexVS纤维。单根纤维的弹性模量约为54 MPa。随后，通过Michael加成反应将细胞黏附肽RGD（arginylglycylaspartic acid）或非黏附对照肽RDG（scrambled）偶联至纤维表面，分别形成“细胞黏附性纤维”和“非黏附性纤维”。将这些纤维以不同体积分数（3%、5%、11%）嵌入不同浓度（2.5–15 mg/ml）的纤维蛋白水凝胶中，制成纤维-水凝胶复合材料（fiber-hydrogel composites, FHCs）。通过扫描电镜（SEM）、共聚焦显微镜、流变学等手段确认了纤维在凝胶内的均匀分布，且纤维的加入不改变凝胶的宏观力学性能和局部纤维蛋白交联密度。

2. 体外细胞培养与形态学分析： 将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）以6×10⁶ cells/ml的密度封装于不同配方的水凝胶中，在添加VEGF和PMA的培养基中培养5天。通过共聚焦显微镜和AngioTool或自编MATLAB脚本定量分析血管网络的总长度、平均节段长度、分支指数等形态参数。同时，利用EdU掺入实验和MTT实验评估细胞增殖和代谢活性，并通过VE-cadherin、鬼笔环肽（phalloidin）等染色观察细胞间连接和细胞骨架。

3. 管腔形成与极性分析： 为评估血管网络是否发生管腔化（lumenogenesis），研究者对培养3天和5天的样本进行了高分辨率共聚焦成像，并联合使用顶端极性标记物Podocalyxin和基底极性标记物Laminin 411进行免疫荧光染色。通过正交视图和线扫描（line scan）分析，定量比较了不同条件下顶端-基底极性的建立情况。

4. 转录组学分析： 在培养18小时后，利用纳豆激酶（nattokinase）消化纤维蛋白凝胶，提取内皮细胞RNA，进行bulk RNA测序（RNA-seq）。使用DESeq2进行差异表达基因分析，利用PANTHER数据库进行GO功能富集分析。研究者还特别关注了与毛细血管形态发生、基质重塑、基质沉积、炎症和机械感知相关的五类基因。

5. 黏着斑与基质形变量化： 培养24小时后，对vinculin进行免疫染色，利用自编MATLAB脚本和Aivia软件进行三维分割，定量分析黏着斑（focal adhesions, FAs）的体积及其与纤维的共定位情况。同时，将荧光微球（直径1微米）嵌入水凝胶，通过活细胞成像连续15小时追踪微球位移，利用TrackMate（ImageJ插件）和自编MATLAB脚本量化细胞牵引力引起的基质形变。

6. 体内移植实验： 由于HUVECs在高密度纤维蛋白中组装能力有限，体内实验改用人肺微血管内皮细胞（HL-MVECs）。将细胞封装于15 mg/ml纤维蛋白水凝胶（含非黏附性纤维或无纤维）中，体外预培养5天后，植入免疫缺陷NSG小鼠的附睾脂肪垫。7天后取出移植物，进行H&E染色和免疫荧光染色，使用Ter-119抗体标记小鼠红细胞、人类核抗原（HNA）抗体标记植入的人源细胞、UEA-I标记人内皮细胞，通过自编MATLAB脚本定量分析宿主细胞浸润、植入内皮细胞存活、移植物血管面积及红细胞灌注情况。

三、主要研究结果

1. 纤维增强内皮细胞网络组装： 在5 mg/ml纤维蛋白中，加入5%（体积分数）的RGD黏附性纤维可显著增加内皮细胞网络总长度，而过高纤维密度（11%）则抑制网络形成。在2.5至15 mg/ml纤维蛋白浓度范围内，含黏附性纤维的FHCs中网络长度均显著高于无纤维对照组，表明合成纤维能够在致密、不利于血管生成的材料中“拯救”内皮细胞的组装能力。然而，黏附性纤维会被细胞募集和致密化，形成局部高密度纤维斑块，并与细胞核碎裂（凋亡标志）和F-actin聚集相关。

2. 非黏附性纤维的意外优势： 与预期相反，用非黏附性RDG功能化的纤维比黏附性RGD纤维更能促进血管生成性组装。在培养第5天，非黏附性FHCs中单个连续F-actin结构包含的细胞数最多，网络总长度和平均节段长度也最高。在长达21天的培养中，非黏附性FHCs维持了最高的网络长度。EdU和MTT实验表明，非黏附性FHCs中的内皮细胞在培养第4天具有最高的增殖率和代谢活性。机制上，非黏附性纤维虽然不能被整合素直接结合，但其高刚度（54 MPa）与周围软基质（ kPa）之间的界面提供了接触引导和机械强化信号，促进了细胞-纤维蛋白基质的相互作用和细胞间力的传递。

3. 管腔化与极性差异： 在无纤维和含非黏附性纤维的凝胶中，内皮细胞网络形成了清晰的管腔，且Podocalyxin顶端定位明确、Laminin 411基底定位正常。而在含黏附性纤维的FHCs中，几乎观察不到管腔。Podocalyxin信号弥散且与纤维位置平行，表明顶端-基底极性被破坏。研究者认为，内皮细胞通过β1整合素与黏附性纤维的直接结合干扰了正常的细胞-基质极性信号，导致细胞优先黏附纤维而非邻近细胞或纤维蛋白基质，从而抑制了管腔化。

4. 转录组学特征： RNA-seq显示，三种基质条件（无纤维、黏附性FHC、非黏附性FHC）的基因表达谱在PCA图中显著分离。在非黏附性FHCs中，与毛细血管形态发生（如CDH5、VEGFA、TEK）、基质重塑（MMP1、MMP10、MMP14、ADAMTS家族）和纤溶相关基因（PLAT、PLAU）高表达；同时，机械敏感基因（VCL、AMOTL2）也上调。炎症相关基因（CXCL2、CXCL5、CXCL8）在两种FHCs中均上调。值得注意的是，线粒体氧化磷酸化基因（MT-ND1/3/4）在非黏附性FHCs中下调，而在黏附性FHCs中上调。GO富集分析显示，非黏附性FHCs富集了更多与细胞过程、细胞-基质相互作用和毛细血管形态发生相关的特异性通路。

5. 黏着斑形成与力传递： 免疫荧光定量显示，非黏附性FHCs中内皮细胞形成的vinculin阳性黏着斑总体积最大。在黏附性FHCs中，约37%的黏着斑与纤维共定位，而在非黏附性FHCs中该比例仅为17%，说明非黏附性纤维促使细胞将黏附主要建立在纤维蛋白基质上。磷酸化FAK（pFAK）染色也支持非黏附性FHCs中更强的黏附信号。活细胞微球追踪实验表明，非黏附性FHCs中荧光微球的平均位移最大，表明细胞在该条件下对周围基质施加了最大的牵引力，可能通过增强的基质形变将机械信号传递给邻近细胞，从而促进网络组装。

6. 体内血管整合： 在植入7天后，仅含非黏附性纤维且预载内皮细胞的移植物中观察到宿主红细胞（Ter-119阳性）出现在管腔内，证明移植物血管与宿主循环实现了吻合。UEA-I和HNA染色显示，纤维的存在显著提高了植入内皮细胞的存活率和血管网络面积。同时，纤维的加入增强了宿主细胞向移植物内部的浸润，无论移植物是否含有内皮细胞。这些结果表明，体外纤维介导的血管网络预形成、纤维促进的内皮细胞存活以及纤维增强的宿主细胞浸润三者共同作用，实现了有效的移植物-宿主血管整合。

四、结论与价值

本研究成功开发了一种基于半合成纤维-水凝胶复合材料的无支持细胞血管化策略。核心发现是，非黏附性（RDG功能化）DexVS纤维比黏附性（RGD功能化）纤维更能促进内皮细胞单培养条件下的血管生成性组装、管腔化、增殖和基质力传递。该策略在体外和体内均验证了其有效性，为组织工程预血管化提供了一种成本更低、体系更简化且可避免支持细胞相关副作用的替代方案。

五、研究亮点

第一，颠覆了“细胞必须直接黏附于生物材料才能有效响应其机械信号”的传统认知，发现非黏附性纤维通过界面效应和间接机械信号即可显著促进血管网络形成。第二，建立了纤维密度、纤维蛋白浓度与血管网络形态之间的定量关系，明确了5%体积分数为最优纤维密度。第三，通过转录组学、黏着斑定量和基质形变追踪的多层次证据链，系统阐明了非黏附性纤维促进血管生成性组装的机制：即通过促进细胞-纤维蛋白基质黏附、增强FAK信号和细胞牵引力传递来实现。第四，体内实验采用了HL-MVECs和15 mg/ml高密度纤维蛋白，确保了植入物的可操作性，并成功证明了纤维介导的预血管化网络能够与宿主循环吻合。该研究的局限性在于DexVS纤维不可降解，未来可探索时间可控的纤维降解策略以进一步优化移植物长期整合。