本文原载于《pnas》2025年第122卷第11期，文章编号e2415805122，于2025年3月11日在线发表。该研究由山东大学、山东第一医科大学、东南大学等多家单位的研究人员合作完成，通讯作者为任佳春（renjiac@seu.edu.cn）、高建刚（jggao@sdu.edu.cn）和付小龙（fuxiaolong@sdfmu.edu.cn）。研究团队主要来自山东省动物细胞与发育生物学重点实验室、山东省立医院耳鼻咽喉科、东南大学生命科学与技术学院等机构，研究领域属于细胞生物学与耳科学交叉方向。

从学术背景来看，顺铂（cisplatin）是临床上广泛应用的化疗药物，但其引起的不可逆性耳毒性严重影响了患者的生活质量。据2020年的一项临床报告，儿童在接受顺铂治疗后听力损失的发生率高达23.5%，而约五分之一的成年患者会出现重度至极重度的听力损伤。目前唯一获FDA批准的防护药物硫代硫酸钠仅被推荐用于肝母细胞瘤患儿，对其他癌症患者尤其是成年患者的保护作用有限。因此，深入阐明顺铂诱导听力损失的分子机制并寻找新的干预靶点具有重要的临床意义。以往研究主要聚焦于毛细胞的损伤机制，但近年来越来越多的证据表明，血管纹（stria vascularis）在维持内耳离子稳态和听觉功能中发挥着关键作用，其中边缘细胞（marginal cells, MCs）是血管纹中最先受顺铂影响的细胞类型。另一方面，焦亡（pyroptosis）作为一种依赖于gasdermin D（GSDMD）的炎症性程序性细胞死亡方式，已被证实在多种炎症性疾病以及顺铂肾毒性中发挥作用，但它在顺铂耳毒性中的具体作用尚不清楚。基于上述背景，本研究旨在探讨GSDMD介导的焦亡在顺铂诱导听力损失中的作用及其机制，并评估靶向GSDMD的治疗潜力。

研究流程上，作者首先通过腹腔注射顺铂建立了6至8周龄C57BL/6N小鼠的耳毒性模型。该模型采用连续4天给药、随后3天恢复的处理方式，共进行两个周期。造模后，作者通过听性脑干反应（auditory brainstem response, ABR）和畸变产物耳声发射（distortion product otoacoustic emission, DPOAE）检测小鼠听力功能，并利用免疫荧光、转录组测序、定量PCR和蛋白印迹等方法分析了耳蜗组织中的形态和分子变化。转录组分析共鉴定出2169个差异表达基因，其中炎症因子相关基因占据关键位置，KEGG通路富集分析显示NOD样受体（NLR）信号通路在顺铂处理后显著富集。进一步通过免疫荧光和蛋白印迹证实，顺铂可激活耳蜗中NLRP3炎症小体，并导致GSDMD的剪切活化。作者使用GSDMD抑制剂necrosulfonamide（NSA）进行干预，发现NSA能显著缓解顺铂引起的听力阈值升高、血管纹变薄和毛细胞丢失。为了排除NSA可能的脱靶效应，作者进一步构建了GSDMD全身敲除（Gsdmd−/−）小鼠，发现这些小鼠在顺铂处理后听力几乎不受影响，血管纹结构保持完整，毛细胞丢失显著减少，耳蜗内铂元素蓄积也明显降低。为确定GSDMD发挥作用的具体细胞类型，作者构建了毛细胞特异性条件敲除小鼠（Atoh1-GSDMD−/−），发现仅敲除毛细胞中的GSDMD并不能保护小鼠免受顺铂耳毒性影响，体外耳蜗外植体实验也支持这一结论。相反，血管纹中边缘细胞在顺铂处理18小时后即出现细胞肿胀和破裂，而GSDMD敲除可显著减轻这种损伤。作者进一步通过转录组和形态学分析发现，顺铂可引起边缘细胞线粒体膜损伤、线粒体异常聚集、氧化应激和细胞色素c释放，而GSDMD敲除可显著缓解这些线粒体功能障碍。为直接证明活化的GSDMD N端片段（GSDMD-N）能够定位于线粒体并介导线粒体损伤，作者在HeLa细胞中过表达了全长GSDMD和GSDMD-N的绿色荧光蛋白融合蛋白，结果显示GSDMD-N与线粒体标记物TOM20共定位。作者还利用AAV1病毒载体在Gsdmd−/−小鼠耳蜗边缘细胞中重新表达GSDMD-N，发现这能消除GSDMD敲除带来的抗顺铂耳毒性保护作用。最后，作者评估了FDA批准的药物双硫仑（disulfiram, DSF）对顺铂耳毒性的保护效果，发现预防性给予DSF可显著改善听力指标，减少毛细胞丢失和血管纹损伤。

研究结果表明，顺铂通过激活耳蜗中GSDMD介导的焦亡通路引起听力损伤，而这一过程主要发生在血管纹的边缘细胞中，而非直接发生于毛细胞。具体数据支持方面，Gsdmd−/−小鼠在ABR测试中各频率听力阈值与正常小鼠接近，而野生型小鼠在顺铂处理后阈值显著升高；Gsdmd−/−小鼠的DPOAE阈值也明显低于野生型顺铂组，说明外毛细胞功能得到保护。在形态学层面，Gsdmd−/−小鼠的血管纹厚度和螺旋神经节神经元密度显著高于野生型顺铂组，血管内皮的损伤和断裂明显减少。在炎症指标方面，Gsdmd缺失显著抑制了顺铂诱导的促炎细胞因子和趋化因子表达上调，并减少了活化巨噬细胞的数量。通过比较耳蜗不同组织中顺铂的蓄积量，作者发现Gsdmd−/−小鼠在血管纹、毛细胞和螺旋神经节中的铂含量均低于野生型顺铂组，提示GSDMD缺失可能通过维持血管纹的屏障完整性限制了顺铂进入内耳。这些结果共同说明，GSDMD介导的边缘细胞焦亡是顺铂耳毒性的上游驱动事件，其导致血管纹功能障碍和炎症反应，进而继发毛细胞退变和听力下降。AAV1介导的GSDMD-N回补实验进一步证实了该分子机制在体内的因果性。此外，DSF干预实验证明药理学抑制GSDMD在临床前模型中有效，为后续临床转化提供了依据。

本研究的结论是GSDMD介导的焦亡在顺铂耳毒性中发挥关键作用，其机制依赖于顺铂激活caspase-11依赖性GSDMD剪切，释放的GSDMD-N片段定位于边缘细胞线粒体并引起线粒体功能障碍和氧化应激，继而触发血管纹损伤和炎症级联反应，最终导致听力损失。这一发现将GSDMD确定为预防顺铂耳毒性的潜在治疗靶点，同时首次系统性地阐明了焦亡在耳蜗血管纹中的致病机制。在应用价值方面，研究证实FDA批准的药物DSF能够在小鼠模型中有效缓解顺铂耳毒性，这为临床上研发新的耳保护策略提供了直接依据。不过作者也指出，既往临床研究显示DSF对顺铂肾毒性无显著保护作用且可能加重胃肠道和耳毒性不良反应，因此其在临床中的应用仍需进一步优化和验证。

本研究的亮点之一在于首次揭示GSDMD介导的焦亡在顺铂耳毒性中的关键作用，并定位到血管纹边缘细胞而非毛细胞，改变了传统研究中过度关注毛细胞损伤的视角。另一个重要发现是活化的GSDMD-N片段可以定位于线粒体并直接导致线粒体功能障碍，这为理解焦亡如何通过线粒体损伤加剧炎症反应提供了新的机制线索。在方法学上，作者结合了全身基因敲除、细胞特异性基因敲除以及基于AAV1的基因回补技术，从整体到靶细胞再到分子功能逐步验证了GSDMD的因果作用，逻辑链条完整。此外，研究还通过ICP-MS分析了耳蜗不同部位的铂蓄积量，揭示了GSDMD缺失可能通过保护血管纹屏障限制顺铂进入内耳的独特机制。该研究为后续开发靶向焦亡的耳保护药物提供了理论支持和实验依据，具有重要的科学和转化医学价值。