海洋模式动物海鞘及其脊索发育与调控

本文作者董波，来自中国海洋大学海洋生命学院及海洋生物多样性与进化研究所，该文以中文形式发表于《科学通报》（Science China Press），2015年第60卷第13期，页码1167至1179。这是一篇学术评述，不是单一原始研究报告。下面将对其主要内容进行系统梳理和详细阐述。

一、海鞘的进化地位

本文的第一个主要观点是：海鞘在动物进化中占据极为关键的位置，是与脊椎动物进化距离最近的无脊椎动物。海鞘属于尾索动物（urochordata），与头索动物（cephalochordata）及脊椎动物（vertebrata）共同组成脊索动物，因为它们都具有脊索（notochord）、背神经管（dorsal hollow nerve cord）和咽鳃裂（pharyngeal gill slit）。作者进一步指出，后来发现半索动物（hemichordates）和棘皮动物（echinoderms）也有鳃裂，因此鳃裂被重新视为后口动物（deuterostomes）的普遍特征，而脊索动物的主要特征被重新归纳为脊索、背神经管、体节（somites）和肛后尾（postanal tail）。传统观点曾长期认为头索动物文昌鱼是脊椎动物最近的无脊椎动物亲戚，因为其终生保留脊索且形态类似鱼类；但近年的基因组和蛋白质组数据比较推翻了这一结论。2002年玻璃海鞘（Ciona intestinalis）基因组公布，随后萨氏海鞘（C. savignyi）、住囊虫（Oikopleura dioica）以及佛罗里达文昌鱼（Branchiostoma floridae）的基因组也相继解析。基于这些数据的系统发育分析表明，头索动物位于脊索动物进化树的基部，而尾索动物才是脊椎动物最近的无脊椎动物近亲。这一观点近年来已成为进化发育生物学领域的重要共识。

二、海鞘的生物学特征及其生态学功能

本文的第二个主要观点是：海鞘作为模式动物具有许多独特的生物学优势，同时在海洋生态系统中承担着极为重要的生态功能。海鞘卵和胚胎透明，身体结构简单。玻璃海鞘中期尾芽幼虫仅有约1579个细胞，其中包括836个表皮细胞、228个神经细胞、218个间充质细胞、36个肌肉细胞、40个脊索细胞和199个中胚层细胞等；孵化后的蝌蚪期幼虫也只有约2600个细胞。海鞘胚胎发育的细胞谱系十分明确，具有镶嵌型发育（mosaic development）的特点。其基因组较小，约为160 Mb，基因数量为15852个，大约是大部分脊椎动物的一半，而且基因组没有经历过复制。这种单拷贝基因组结构使基因功能研究更加直接和便捷。更重要的是，约80%的海鞘基因可以在人类等脊椎动物中找到同源基因。在生态功能方面，海鞘是重要的滤食性海洋生物类群，种类多、数量大、分布广、繁殖力强。附着类海鞘如玻璃海鞘和柄海鞘会影响海洋生物群落结构、浅海环境容纳量以及养殖动物的存活与产量；浮游性海鞘如住囊虫则是浮游动物的重要类群，其废弃的背囊是海洋雪（marine snow）的重要组分，其种群数量会随大洋藻华迅速扩大，因此可作为海洋环境指示物种。由于海鞘数量庞大且滤食能力极强，它在海洋生态系统碳循环中起着重要的调控作用。

三、海鞘研究的技术手段与共享资源

本文的第三个主要观点是：海鞘研究在技术上已经高度成熟，并建立了丰富的公共网络资源。在遗传操作方面，玻璃海鞘和萨氏海鞘已能实现实验室全人工繁殖；基于I-SceI内切酶、Minos转座子和Sleeping Beauty转座子的稳定转基因系统已经建立，并获得了100多个稳定的转基因海鞘品系。日本筑波大学的CITRES和美国加州大学圣巴巴拉分校的ASC两个机构可以提供这些转基因品系的冷冻精子或成体以及相关质粒。正向遗传学筛选也已获得多个重要的发育突变体。在胚胎操作方面，胚胎解剖、显微注射、活体染色、免疫荧光组化、原位杂交等技术均已成熟应用。近年来，荧光蛋白标记和共聚焦显微镜实时成像技术为提高海鞘发育生物学研究效率提供了重要工具。日本庆应义塾大学构建了玻璃海鞘胚胎发育不同阶段的四维时序图像和三维影像，可在FABA网站获取。在数据库方面，Kyoto大学提供的GHOST网站包含玻璃海鞘和萨氏海鞘的基因组和原位杂交图像数据；Ensembl和JGI也提供海鞘基因组数据；CiPRO提供蛋白质组学数据；ANISEED是一个综合性海鞘数据库；OikoBase则提供住囊虫的全基因组数据。更为重要的是，锌指蛋白核酸酶（ZFNs）、转录激活子样效应因子核酸酶（TALENs）、CRISPR/Cas9介导的基因敲除以及基于表观遗传学机制抑制母源RNA表达的MASK技术都已在海鞘中成功应用。这些技术的建立和资源的开放共享大大促进了海鞘基础生物学研究的发展，使海鞘成为遗传、细胞和发育生物学研究的重要模式物种。

四、海鞘脊索的起源与发生

本文的第四个主要观点是：脊索起源于约5.5亿年前的脊索动物祖先，是脊索动物最显著的特征器官，而海鞘脊索是研究脊索发生和功能的优良系统。脊索在所有脊索动物胚胎中都存在，有些种类如文昌鱼和住囊虫终生保留脊索，而在高等脊椎动物中脊索骨化成为椎间盘髓核的重要组分。脊索的功能主要有两方面：一是支撑身体结构，维持前后和背腹轴向；二是在胚胎中发挥信号组织中心的作用，诱导中枢神经系统、心血管系统和体节等组织的分化与定位。海鞘的脊索只存在于胚胎及幼虫时期，在幼虫变态为成体过程中退化消失。海鞘脊索位于幼虫尾部中央，周围被36个肌肉细胞包裹，背侧是神经管。海鞘脊索仅由40个细胞组成，分别来自A分裂球和B分裂球两个细胞谱系。T盒子（T-box）基因Brachyury是诱导脊索发生和分化的核心基因，它在64细胞期开始特异地表达于脊索组织。抑制Brachyury表达会阻止脊索形成；在非脊索组织中过表达Brachyury则可诱导异源脊索的产生；在Brachyury缺失的突变体中，脊索命运分化和随后的变态过程受到严重影响。此外，其他T盒子家族成员如Tbx2/3以及大量Brachyury下游基因也在脊索发育中起重要作用。脊索细胞的发生还需要细胞间相互作用，例如中胚层细胞产生的成纤维细胞因子（FGF）是诱导脊索形成的必要信号分子，脊索前体细胞也需要调控自身信号通路以正确响应FGF信号。

五、海鞘脊索发育的细胞学过程及其调控机制

本文的第五个主要观点是：海鞘脊索发育经历了极为复杂的细胞学过程，其管腔形成方式是一种全新的生物管腔生成模式。由于脊索细胞数目少、个体大，海鞘脊索成为细胞发育生物学研究的理想模式组织。作者综合Munro和Odell对Boltenia villosa和Corella inflata脊索发育前期以及Dong等人对玻璃海鞘脊索发育后期的描述，将海鞘脊索发育分为两个阶段、七个时期。第I期为神经胚形成早期，20个脊索细胞完成最后一次分裂，形成四排共40个细胞。第II期为神经胚中后期，40个脊索细胞在背腹轴变窄、前后轴延伸，脊索盘边缘的细胞开始内陷至中轴线位置。第III期为尾芽早期，细胞形成以肌动蛋白为骨架的胞膜突起，进行细胞迁移和相互间插，最终在中轴线沿前后轴形成一列单层细胞圆柱体。这一基于细胞间插的汇聚伸展（convergence and extension）过程需要FGF3信号诱导、Wnt/平面细胞极性（PCP）通路参与以及细胞外基质层粘连蛋白（laminin）的作用。第IV期是本文重点描述的新机制驱动脊索细胞延伸的阶段。此时脊索细胞呈“硬币状”，随后沿背腹轴变窄并沿前后轴延伸约两倍，但细胞体积保持不变。研究发现，肌动蛋白和非肌肉肌球蛋白II（non-muscle myosin II）在基底膜（basal membrane）中央形成收缩环结构，其收缩产生的机械力通过黏性细胞质传递到细胞前后侧膜，转化为前后方向的推力，驱动细胞延伸。这一过程涉及多种肌动蛋白结合蛋白，如原肌球蛋白（tropomyosin）、踝蛋白（talin）和肌动蛋白切割蛋白（cofilin）的共同调控。第V期为间质细胞向上皮细胞转化（mesenchymal-epithelial transition, MET）和腔液开始分泌阶段。脊索细胞膜发生极性化，形成面向腔液的顶端膜、细胞间接触的侧面膜以及与胞外基质接触的基底膜三个区域。顶端膜蛋白如离子运输蛋白Slc26-2和极性蛋白Par3、Par6及非典型蛋白激酶（aPKC）开始出现，含有腔液蛋白的小泡被运输到顶端膜并释放到细胞外。第VI期腔液体积显著增加，脊索细胞开始双向迁移，打破圆柱对称性。第VII期隔离的腔液融合，细胞变成内皮样扁平细胞，形成密闭的充满腔液的脊索管。在此过程中，细胞在前后轴方向完成第二次细胞间插，从一排细胞变为两排细胞，细胞形态从圆柱形变为三角锥形最终成为规则的六边形。这种通过细胞迁移和重排形成管腔的方式首次在海鞘中被发现，随后在斑马鱼微血管和肠腔管道形成中也发现了类似过程，表明这一机制在进化上是保守的。

六、海鞘生物学研究的近况与展望

本文的第六个主要观点是：海鞘研究在国际上持续深入，中国的贡献也具有重要的历史地位和现实意义。最近五年，随着基因组解析和基因操作技术的进步，海鞘中许多重要器官发育的独特细胞生物学过程和分子信号转导途径被揭示，海鞘还被作为普遍模式研究心脏、神经系统和脊索等器官的发生发育及调控网络。中国科学家对海鞘研究有重要贡献：童第周先生早在20世纪30年代就用活体染色方法研究细胞质组分在海鞘卵中的定位及其对细胞分化的影响，并通过精巧的核移植实验证明决定细胞分化的遗传信息来自细胞质而不是已分化的细胞核。这一论断后来被日本科学家鉴定出的肌肉分化决定子macho-1从分子水平上证实。20世纪80年代以来，海鞘在我国主要作为污损生物和滤食生物被研究，基础发育生物学研究相对较少。近年来，国内学者已描述了我国海区几种海鞘的胚胎及幼虫发育过程。作者提出，我国亟需建立海洋模式动物系统，对基本生物学过程进行系统研究，未来研究应集中在重要器官的遗传发育生物学、生物感受环境变化的分子途径以及适应复杂环境的遗传基础等方面。此外，牡蛎、珍珠贝、珊瑚、甲藻、水母、半滑舌鳎、虹鳟鱼、菊黄东方鲀等海洋物种的基因组已经陆续公布，这些物种未来可能成为研究特定生物学过程的新模式物种。

七、本文的学术意义与价值

本文系统梳理了海鞘作为海洋模式动物的进化地位、生物学特征、生态学功能、技术资源以及脊索发育的细胞学过程和分子调控机制。文章不仅全面介绍了海鞘研究的前沿进展，而且强调了海鞘脊索作为研究生物管腔形成和细胞形态发生的独特价值。特别重要的是，海鞘脊索管腔形成所展现的“通过细胞迁移和重排形成管道”的机制在脊椎动物中同样存在，说明海鞘研究对理解人类相关发育和疾病过程具有潜在价值。此外，文章还回顾了中国科学家在海鞘研究中的历史贡献，并对未来海洋模式动物研究方向提出了建设性意见，对推动我国海洋基础生物学研究具有积极的指导意义。