本次研究发表在《Advanced Healthcare Materials》期刊上，第一作者为Duan, Jing，通讯作者包括Fang, Yongcong（清华大学）、Yang, Bin（中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院）和Xiong, Zhuo（清华大学）。该研究的主要参与单位还包括北京大学第三医院。这是一项原创性研究论文。

学术背景

本研究属于生物制造与骨组织工程（Bone Tissue Engineering, BTE）交叉领域，聚焦于修复临界尺寸颅骨缺损这一临床难题。传统骨组织工程常采用“自上而下”的策略，即将细胞接种于生物材料支架上，这种方法存在细胞分布不均、营养物质扩散受限、难以复制骨骼复杂结构，以及最关键的是缺乏有效血管化网络等问题，导致中心区域细胞坏死或生长停滞，影响大尺寸骨组织的快速再生。

近年来，基于发育工程学（Developmental Engineering）理念的“自下而上”策略受到关注，其通过模拟胚胎发育过程，使用细胞聚集体（如间充质干细胞MSCs球体）作为构建单元来组装骨组织。然而，现有的MSCs聚集体通常需要较长的体外成骨诱导时间，且缺乏内在的血管化能力，难以实现快速的原位骨再生。

为解决这些挑战，本研究提出了一种创新策略：将MSCs、人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和成骨性微颗粒（Microparticles, MPs）相结合，大规模制备具有自组织血管化和增强成骨特性的预血管化骨类器官，并进一步结合3D生物打印技术，构建用于快速原位颅骨再生修复的厘米级复合组织。

详细研究流程

研究主要包含以下五个关键流程：

1. 预血管化成骨聚集体的构建与优化筛选 * 研究对象与方法：研究首先采用“强制聚集”技术，将MSCs和HUVECs（比例未明确说明，但从上下文推断可能为共培养）与四种不同的成骨微颗粒——羟基磷灰石（HAP）、生物活性玻璃（BG）、氧化石墨烯（GO）以及聚多巴胺（PDA）包覆的HAP颗粒——分别混合，在Aggrewell培养板中形成多细胞聚集体。微颗粒与MSCs的比例设定为1:1。每组样本数量用于表征的聚集体数量较多（例如直径测量n=39）。 * 实验内容：对形成的聚集体进行为期14天的培养和表征。包括：(1) 形态与尺寸分析：通过显微镜观察并测量聚集体直径。(2) 细胞活力与增殖评估：使用活/死染色和CCK-8法检测细胞活性和增殖率。(3) 成骨潜能评估：培养第7天和第14天时，通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测关键成骨基因（ALP, COL-1, RUNX-2, BMP-2, OPN）的表达水平。同时，对培养14天的聚集体进行COL-1蛋白的免疫荧光染色。 * 新颖方法：本研究系统地比较了不同微颗粒在3D球体微环境中对细胞增殖和成骨分化的影响，这是一种针对成骨诱导材料筛选的优化策略。

2. GO负载的预血管化骨类器官的生成与评估 * 研究对象：基于上一流程的结果，选择成骨效果最优的GO微颗粒，构建包含MSCs、HUVECs和GO的预血管化骨类器官（M+H+GO组），并与不含GO的预血管化聚集体（M+H组）以及仅含MSCs和GO的聚集体（M+GO组）等进行对比。 * 实验内容： * 形貌与结构：通过光学显微镜、扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察聚集体的宏观形貌、表面结构以及GO与细胞的相互作用。 * 成骨特性验证：进行碱性磷酸酶（ALP）染色和阿利新红染色（ARS），分别评估早期成骨分化和晚期钙盐沉积情况。 * 血管化能力评估：将聚集体嵌入胶原I-Matrigel基质中，在3小时和8小时观察并量化HUVECs形成的管状网络结构（分支数、管长、连接点数）。通过CD31免疫荧光染色进一步确认聚集体内部的血管内皮特征。 * 数据分析流程：图像分析使用ImageJ软件，定量数据通过统计学方法（如ANOVA）比较组间差异。

3. GO促进成骨分化机制的探索 * 研究对象与方法：对培养7天的M+H+GO组和M+H组细胞聚集体进行mRNA测序（RNA-seq）。 * 实验与数据分析： * 测序与差异表达基因（DEGs）鉴定：通过PCA分析确认组间基因表达差异，筛选出显著上调和下调的DEGs。 * 生物信息学分析：对DEGs进行基因本体论（GO term）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，识别关键生物学过程和信号通路。 * 基因集富集分析（GSEA）：聚焦于富集程度最高的通路进行深入分析。 * 实验验证：通过qPCR和蛋白质印迹法（Western Blot）对RNA-seq提示的关键通路（如PI3K/Akt、黏着斑通路）中的相关基因（PI3K, Akt, FAK, β-catenin, COL1A1）和蛋白（COL1A1, PI3K p85α, Akt）表达水平进行验证。 * 机制阐释：基于上述结果，本研究提出了GO促进3D聚集体成骨的可能分子机制：GO通过其高比表面积和特性，增强细胞-基质相互作用，激活整合素-FAK信号，进而通过调节细胞骨架张力激活YAP/TAZ转录因子，并同时通过FAK-PI3K-Akt轴激活β-catenin，共同促进成骨相关基因表达和细胞外基质（尤其是I型胶原）沉积，为生物矿化提供支架并加速过程。

4. 基于3D生物打印的预血管化骨类器官放大化制造 * 研究对象与方法：将预血管化骨类器官作为“生物墨水”的功能单元，封装于甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶中，形成复合生物墨水。 * 实验内容： * 材料优化：测试不同浓度（5%, 7.5%, 10%）GelMA的流变特性（温度响应性、剪切稀化性、应变屈服性），最终选择7.5%浓度作为打印载体。 * 3D生物打印：使用商用生物打印机，将复合生物墨水打印成网格状结构。优化打印参数（速度、挤出速率），并在打印后使用405nm光进行交联固化。 * 打印结构评估：打印后立即进行活/死染色评估细胞活性。在培养第1、3、7天，通过F-actin和DAPI染色观察细胞在凝胶中的形态演变和网络形成。通过CD31免疫荧光以及使用表达绿色荧光蛋白（GFP）的MSCs和表达红色荧光蛋白（RFP）的HUVECs进行活细胞成像，动态观察打印结构内血管网络的自组织与延伸。 * 新颖方法：将具有预成型血管网络的骨类器官作为构建块进行生物打印，旨在实现打印组织中“即插即用”式的血管化，这是本研究的核心创新点之一。

5. 预血管化骨类器官促进颅骨缺损快速原位再生的体内实验 * 研究对象：在大鼠颅骨上制造直径4毫米的临界尺寸缺损模型。将大鼠分为四组：空白对照组（无填充）、GelMA+M+H组、GelMA+M+GO组、GelMA+M+H+GO组。每组样本量未明确说明，但提及定量分析n=3。 * 实验与评估方法： * 骨再生评估：在植入后第4周和第8周，通过微型计算机断层扫描（micro-CT）进行成像，并定量分析骨矿物质密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）和新骨面积。第8周时，取颅骨样本进行苏木精-伊红（H&E）染色、Masson三色染色以及骨钙素（OCN）免疫荧光染色，从组织学层面评估新骨形成和质量。 * 血管化评估：植入后第8周，通过磁共振血管成像（MRA）在体观察缺损区域新生血管网络的3D形态并计算血管体积。对组织切片进行CD31免疫荧光染色，量化局部血管密度。 * 免疫反应评估：对组织切片进行巨噬细胞表型标志物CD68（M1型）和CD163（M2型）的免疫荧光双染，计算M2/M1比例，评估植入物的免疫调节作用。

主要研究结果

1. 微颗粒筛选结果：GO微颗粒在所有测试的成骨微颗粒中表现出最优的成骨诱导能力。与对照组相比，GO组在培养14天后，关键成骨基因（ALP, COL-1, RUNX-2, BMP-2, OPN）的表达上调倍数最高（例如ALP上调6.42倍，COL-1上调8.72倍）。COL-1蛋白表达也显著高于其他组。因此，GO被选为构建功能化骨类器官的最佳成骨组分。
2. GO负载骨类器官的特性：M+H+GO聚集体成功形成，具有高细胞活性和致密结构。ALP和ARS染色证实GO的加入显著增强了聚集体的早期成骨分化和晚期矿化能力。Matrigel管形成实验和CD31染色表明，加入HUVECs的组（M+H和M+H+GO）能有效形成毛细管样网络，且GO的加入不损害其血管生成能力。这些聚集体被定义为兼具成骨和血管化潜能的“预血管化骨类器官”。
3. 机制研究结果：RNA-seq分析发现，GO处理组有1523个DEGs。富集分析显著集中在“细胞外基质”、“黏着斑”和“PI3K-Akt信号通路”。GSEA进一步确认了这两条通路被激活。Western Blot验证了M+H+GO组中COL1A1、PI3K p85α和Akt蛋白表达量显著高于M+H组。这证实GO主要通过调控细胞与ECM的黏附以及激活PI3K/Akt信号通路来驱动成骨分化。
4. 3D生物打印结果：使用7.5% GelMA及优化参数，成功实现了预血管化骨类器官的高密度（60%体积分数）打印，打印后细胞存活率高达85.63%。打印结构中的类器官能够在培养过程中扩展、拉伸并相互连接。活细胞成像显示，GFP-MSCs和RFP-HUVECs在打印结构内共存，并且HUVECs能够延伸形成原始的血管网络，证明了打印后血管化能力的保持。
5. 体内实验主要结果：
   • 骨再生：Micro-CT和定量分析显示，植入8周后，M+H+GO组的骨再生效果最佳，其BV/TV（32.28%）显著高于其他各组（分别是M+H组的2.13倍，M+GO组的2.32倍，对照组的4.11倍）。组织学染色（H&E, Masson）和OCN荧光定量均一致表明，M+H+GO组的新骨形成最广泛、最成熟。
   • 血管化：MRA和CD31染色显示，含有HUVECs的组（M+H和M+H+GO）在缺损区域内新生血管的密度和体积均显著高于不含HUVECs的组（M+GO和对照组）。这表明预血管化策略有效促进了宿主血管的长入和整合。
   • 免疫调节：含有GO的植入物（M+GO和M+H+GO组）显著提高了局部巨噬细胞中抗炎M2型与促炎M1型的比例，表明GO具有诱导有利的免疫微环境的能力，这可能间接促进了血管生成和骨再生。

结论与意义

本研究成功地开发并验证了一种融合发育工程学与先进生物制造的新策略。该策略的核心是创制出预血管化骨类器官，并将其作为功能化构建单元，通过3D生物打印技术规模化定制用于修复不规则颅骨缺损的活性植入物。

其科学价值在于：1）系统比较并确定了GO在3D细胞聚集体微环境中的卓越成骨效能，并深入阐明了其通过激活黏着斑和PI3K/Akt通路促进成骨的分子机制；2）实现了“成骨”与“血管化”两大关键功能在细胞聚集体层面的同步整合与提前预设，突破了传统方法中血管化滞后于成骨的瓶颈；3）为“自下而上”构建复杂组织提供了新的范式，即使用功能完备的“模块化”生物单元（类器官）进行组装，而非从零开始诱导分化。

其应用价值显著：该策略能够实现快速的原位骨再生，大幅缩短了传统组织工程所需的漫长体外培养时间。所制备的植入物具有与生理相近的高细胞密度、内在的血管网络和强大的成骨能力，为临床修复大尺寸、形状复杂的骨缺损（尤其是血供较差的颅颌面区域）提供了一种极具前景的、可规模化且有效的解决方案。

研究亮点

1. 功能创新：首次报道了集“自组织血管化”与“增强型成骨诱导”于一体的预血管化骨类器官的构建，并将其成功应用于3D生物打印。
2. 策略创新：提出了“类器官作为生物墨水”的“模块化”生物制造新思路，将发育生物学原理与制造技术紧密结合，实现了从微观细胞自组织到宏观定制化植入物的一体化制备。
3. 机制深入：不仅验证了GO的成骨效果，还通过多组学（转录组）结合分子生物学实验，深入揭示了其在3D聚集体中促进成骨分化的关键信号通路（黏着斑与PI3K/Akt通路），为材料生物学效应提供了机理层面的理解。
4. 验证全面：研究从体外材料筛选、细胞功能评价、分子机制探索，到体外3D打印构建、体内大动物模型疗效验证（包括骨再生、血管化、免疫调节多角度），形成了完整、严谨的证据链条，论证充分。
5. 临床导向性强：整个研究设计直指临床临界尺寸骨缺损修复的难点（快速、血管化、形状适配），最终在大鼠颅骨缺损模型中证明了治疗有效性，向临床转化迈出了坚实的一步。