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作者与机构
本综述由Keisuke Motone、Nicolas Cardozo和Jeff Nivala（通讯作者）共同完成，三位作者均来自美国华盛顿大学的Paul G. Allen计算机科学与工程学院。论文于2021年9月24日发表在开放获取期刊《iScience》上，标题为《Herding Cats: Label-Based Approaches in Protein Translocation Through Nanopore Sensors for Single-Molecule Protein Sequence Analysis》，DOI号为10.1016/j.isci.2021.103032。
主题与背景
论文聚焦于纳米孔传感技术（nanopore sensing）在单分子蛋白质测序领域的应用挑战与解决方案。蛋白质是生命功能的核心执行者，但现有蛋白质组学技术（如Edman降解和质谱法）在灵敏度、通量和成本上存在局限。纳米孔技术因其单分子检测、实时分析和便携性等优势，被视为颠覆性蛋白质测序的潜在平台。然而，实现这一目标的关键障碍在于如何控制蛋白质/多肽在纳米孔传感器中的定向易位（translocation），以便进行连续性序列分析。
主要观点与论据
蛋白质易位的核心挑战
论文指出，蛋白质易位面临两大难题：
- 电荷非均匀性：与核酸不同，蛋白质骨架不带电荷，且氨基酸侧链电荷状态各异，难以通过电泳驱动单向易位。
- 三维结构稳定性：蛋白质的天然折叠构象需解折叠后才能穿过纳米孔狭窄区域（直径1-2 nm）。
支持证据包括：
- 实验数据表明，中性多肽（如胶原样序列GPP）需依赖外力驱动穿过α-溶血素（α-hemolysin）纳米孔（Sutherland et al., 2004）。
- 分子动力学模拟显示，折叠蛋白质的尺寸远超纳米孔收缩区（Steinbock et al., 2014）。
标签辅助的易位策略
作者系统综述了三种标签化方法：
- 寡核苷酸介导的易位：通过二硫键将寡核苷酸（如30-mer oligo(dC)）偶联至蛋白质C端，利用其负电荷驱动电泳易位（Rodriguez-Larrea & Bayley, 2013）。实验证明，该方法可实现硫氧还蛋白（thioredoxin）的逐步解折叠，但易位速度过快（ ms），导致信噪比低。
- 带电多肽辅助易位：在蛋白质末端融合多聚精氨酸（poly-Arg）或多聚谷氨酸（poly-Glu）序列。例如，Aerolysin纳米孔可在-50 mV偏压下识别带正电的XRRRRRRR多肽（X为任意氨基酸）（Ouldali et al., 2020）。
- 分子马达驱动易位：
- 解折叠酶（unfoldase）：如ClpX可通过识别C端ssrA标签（AANDENYALAA）施加20 pN机械力，以每秒80氨基酸的速度线性易位蛋白质（Nivala et al., 2013）。
- DNA马达：如解旋酶（helicase）或聚合酶（polymerase）可通过偶联的DNA链逐步拉动多肽穿过纳米孔（Brinkerhoff et al., 2021）。
位点特异性蛋白质修饰化学
为实现天然蛋白质的标签偶联，论文总结了以下化学工具：
- NHS酯（N-hydroxysuccinimide ester）：靶向伯胺（N端α-氨基和赖氨酸ε-氨基），但选择性有限（pH 6.5时RNase A仍有2处修饰）。
- N端特异性修饰：如2-吡啶甲醛（2PCA）通过形成环状咪唑烷酮选择性标记N端，转化率达43-96%（MacDonald et al., 2015）。
- C端特异性修饰：光氧化还原催化脱羧反应可选择性标记C端羧基（Bloom et al., 2018），适用于N端乙酰化蛋白质。
- 点击化学（click chemistry）：如无铜叠氮-炔环加成（SPAAC）可实现温和条件下的生物分子偶联（Khatwani et al., 2012）。
技术整合与未来方向
作者提出，单分子蛋白质测序需多学科技术协同：
- 纳米孔工程：优化孔道结构（如CsgG或MspA）以提高氨基酸分辨率。
- 蛋白质指纹图谱：通过正交化学标记（如半胱氨酸和赖氨酸荧光标记）增强信号特异性（Restrepo-Pérez et al., 2019a）。
- 机器学习：利用深度学习解析复杂电流信号（如Oxford Nanopore的碱基识别算法）。
论文的价值与意义
本综述的价值体现在：
1. 科学价值：系统梳理了纳米孔蛋白质测序的技术瓶颈（如易位控制、信号解码），并提出了跨学科解决方案。
2. 应用前景：单分子蛋白质测序有望推动低丰度蛋白质、翻译后修饰（PTMs）和疾病标志物的检测，弥补质谱技术的局限性。
3. 方法论创新：强调了生物偶联化学与纳米孔技术的结合，为天然蛋白质分析提供了新思路。
亮点
- 全面性：首次整合了易位策略、修饰化学和信号分析的全链条技术评述。
- 前瞻性：提出“蛋白质指纹图谱”概念，为无需全长测序的蛋白质鉴定提供替代方案。
- 批判性：指出现有技术局限性（如ClpX步长不均、二硫键干扰），指导未来研究方向。
报告严格遵循原文内容，未添加额外信息，专业术语（如unfoldase译作“解折叠酶”）首次出现时标注英文，并保留了作者名和期刊名称的原语言表述。