黄晓霞、李冰玉等研究人员在Frontiers in Physiology期刊上发表了一项关于晚期糖基化终末产物（advanced glycation endproducts, AGEs）介导慢性肾损伤的原创性研究。该研究于2022年9月9日发表，研究团队主要来自南方医科大学广东省心功能与微循环重点实验室、南方医科大学第二临床医学院、南方医科大学南方医院麻醉科以及南方医科大学顺德医院。研究的通讯作者为崔韵和黄巧冰。该研究旨在阐明AGEs在不同阶段诱导肾脏损伤的特征性模式，并探讨moesin磷酸化在此过程中的作用。
糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，其发生发展与高血糖引起的AGEs蓄积密切相关。AGEs是非酶糖基化蛋白衍生物，在糖尿病、代谢功能障碍及衰老状态下因清除不足而在血浆和组织中积累。肾脏是糖尿病患者AGEs沉积的主要器官。已有研究表明AGEs与其受体（receptor for advanced glycation endproducts, RAGE）结合后可通过多种细胞内信号通路导致肾衰竭。ERM蛋白家族（ezrin、radixin、moesin）作为跨膜蛋白与细胞骨架之间的连接蛋白，参与细胞极性、迁移、管腔形态发生等过程。moesin是内皮细胞中主要表达的ERM蛋白，其T558位点磷酸化与AGE诱导的血管生成过程有关。然而，moesin磷酸化是否参与AGE诱导的肾脏内皮功能障碍和血管生成尚不清楚。因此，本研究旨在建立AGE-BSA刺激的动物模型，比较不同时间阶段AGE/RAGE诱导的肾血管生成和纤维化，并探讨moesin磷酸化的作用。
本研究采用C57BL/6野生型（wild-type, WT）小鼠、RAGE基因敲除（RAGE(−/−)）小鼠和moesin基因敲除（Msn−/y）小鼠，通过腹腔注射AGE-BSA（每日10 mg/kg）持续1个月或6个月建立慢性肾损伤模型。研究主要分为以下几个实验部分：首先，通过免疫组织化学染色检测内皮细胞特异性标志物CD34，评估肾小球周围血管生成情况；同时利用HE染色观察肾组织形态学改变，包括微血管扩张充血、肾小球面积变化等。其次，采用透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察足细胞足突完整性、肾小球内皮细胞连续性以及肾小球基底膜（glomerular basement membrane, GBM）厚度等超微结构改变。第三，通过PAS染色和Masson三色染色评估肾纤维化程度，其中PAS染色指示系膜基质和基底膜，Masson染色指示胶原纤维沉积。第四，通过自动生化分析仪检测尿白蛋白/肌酐比值、血肌酐和血尿素氮水平以评估肾功能。第五，通过免疫组织化学和Western blot检测moesin磷酸化水平，并利用TSA（tyramide signal amplification）技术进行磷酸化moesin与CD34的双重免疫荧光共定位分析。第六，利用moesin基因敲除小鼠验证moesin缺失对AGE-BSA诱导肾纤维化的影响。第七，在体外培养肾小球内皮细胞（glomerular endothelial cells, GECs），通过腺病毒转染野生型moesin、组成性激活突变体T558D和磷酸化缺陷突变体T558A，并利用Matrigel管腔形成实验检测moesin T558磷酸化在AGE诱导的肾小球内皮细胞管腔形成中的作用。
研究结果显示，AGE-BSA刺激1个月后，CD34染色显示肾小球Bowman囊周围出现明显扩张的新生血管，HE染色可见肾小球和肾小管周围充满红细胞的扩张微血管，甚至微动脉瘤形成。然而6个月后，CD34阳性区域明显减少，扩张微血管消失，取而代之的是肾小球和肾小管萎缩及肾小管上皮细胞空泡变性。这些短期促血管生成和长期萎缩效应在RAGE(−/−)小鼠中均显著减弱。TEM结果显示，AGE-BSA处理1个月即可见足细胞足突融合和脱离，足突连接数减少，6个月时更加明显，同时出现肾小球内皮细胞衬里中断和GBM不均匀增厚。这些超微结构损伤在RAGE(−/−)小鼠中得到改善。PAS和Masson染色显示AGE-BSA处理1个月时肾小球内有轻度PAS染色增强和胶原沉积，6个月时PAS染色显著增强，胶原纤维在间质区大量沉积，肾小球难以辨认。RAGE(−/−)小鼠未见明显PAS阳性染色或胶原沉积。肾功能检测显示AGE-BSA处理1个月即出现白蛋白尿显著增加，6个月时白蛋白尿更加严重，同时血肌酐和血尿素氮水平升高。这些功能改变在RAGE(−/−)小鼠中均被抑制。免疫组织化学和Western blot结果显示AGE-BSA处理后肾小球血管内皮细胞及新生血管内皮细胞中磷酸化moesin染色显著增强，6个月时仍保持强阳性。RAGE(−/−)小鼠中moesin磷酸化无明显变化。双重免疫荧光共定位分析显示AGE-BSA处理组磷酸化moesin与CD34的共定位系数为0.78±0.02，显著高于对照组（0.18±0.07）和BSA组（0.28±0.09），表明AGE处理后moesin磷酸化主要发生在内皮细胞中。moesin基因敲除小鼠实验显示，与AGE处理的WT小鼠相比，AGE处理的Msn−/y小鼠PAS和Masson染色明显减轻，肾小球萎缩得到改善，表明moesin磷酸化在AGE诱导的肾纤维化中发挥作用。体外GECs管腔形成实验证实AGE-BSA显著增强GECs管腔形成能力，组成性激活突变体moesin T558D本身即可增强管腔形成，而磷酸化缺陷突变体moesin T558A则抑制AGE-BSA诱导的管腔形成，表明moesin T558磷酸化在AGE诱导的肾小球血管生成中起关键作用。
本研究结论认为，AGEs通过与RAGE结合并诱导moesin磷酸化，介导具有特征性模式的慢性肾损伤。在AGE-BSA刺激早期（1个月），主要表现为肾小球周围异常血管生成、肾小球肥大和系膜扩张；而在晚期（6个月），则表现为肾小球萎缩和肾间质纤维化。足细胞足突损伤和GBM不均匀增厚随时间进展而加重，肾功能障碍与形态学改变相伴随。RAGE基因敲除可显著减轻AGE-BSA诱导的上述病理改变，moesin缺陷可减轻AGE-BSA诱导的肾纤维化，moesin T558磷酸化对AGE诱导的肾小球内皮细胞管腔形成至关重要。该研究揭示了AGEs在DN不同阶段发挥不同病理效应的动态变化特征，阐明了AGE-RAGE-moesin磷酸化信号轴在糖尿病肾病进展中的作用。这项研究为DN的发病机制提供了新的认识，即AGEs不仅通过传统的氧化应激和炎症途径导致肾损伤，还通过早期促血管生成和晚期促纤维化的时相性转换发挥作用。这一发现对DN的分期防治具有潜在指导意义，提示早期干预血管生成和晚期干预纤维化可能成为针对性治疗策略。同时，moesin T558磷酸化作为AGE-RAGE下游的关键信号节点，可能成为DN治疗的潜在靶点。
该研究的亮点在于：首次系统性地在同一动物模型中比较了AGEs短期和长期刺激对肾脏的不同影响，揭示了AGE诱导肾损伤的阶段性特征；利用RAGE基因敲除和moesin基因敲除小鼠从体内验证了AGE-RAGE-moesin磷酸化信号通路的完整性；利用TSA双重免疫荧光技术在同源抗体条件下实现了磷酸化moesin与CD34的共定位检测；通过腺病毒转染不同磷酸化状态的moesin突变体在肾小球内皮细胞中明确了T558磷酸化的功能意义。此外，研究还发现AGE-BSA处理1个月即可引起足细胞足突融合和蛋白尿，早于明显的肾小球纤维化，这为DN的早期诊断和干预时机提供了实验依据。研究也存在一定局限性，如缺乏对分子机制的深入探索，以及未阐明磷酸化moesin在不同阶段是否发挥不同作用等。