本文原载于 The AAPS Journal 第16卷第5期（2014年9月出版），第一作者为 Hans Christian Helms，通讯作者为 Birger Brodin，研究单位包括丹麦哥本哈根大学健康与医学学院药学系以及 H. Lundbeck A/S 的 Discovery DMPK 部门。该研究围绕血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）体外模型中三磷酸腺苷结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运体的功能表达展开，系统评估了 P-糖蛋白（P-gp/ABCB1）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP/ABCG2）和多药耐药相关蛋白（MRPs/ABCCs）在外排转运中的作用。

从学术背景看，血脑屏障通过脑毛细血管内皮细胞之间的紧密连接网络、代谢酶以及药物转运体共同限制血液与脑组织间液之间的物质交换。P-gp、BCRP 和 MRP 等 ABC 转运体主要定位于内皮细胞的管腔膜（luminal membrane），可主动将多种药物从脑内向血液方向外排，是限制中枢神经系统药物进入脑实质的重要原因。此前已有多种牛脑内皮细胞体外模型被用于研究 BBB 转运功能，但大多数模型的跨内皮电阻（transendothelial electrical resistance, TEER）仅为 100–300 Ω·cm²，远低于体内估算的 1000–2000 Ω·cm²。较低的电屏障特性可能导致较大的细胞旁路通量，从而掩盖由外排转运体介导的跨细胞极性转运。因此，本研究的目标是在一种经过改良的高电阻牛脑内皮/大鼠星形胶质细胞共培养模型中，评估其是否表现出已知外排底物的极性转运，并进一步解析所涉及的转运体类型。

在实验流程方面，作者首先从新生牛脑灰质中分离脑微血管片段，经酶消化、过滤和冻存后复苏培养，获得原代脑微血管内皮细胞。星形胶质细胞则从大鼠脑中分离并培养。共培养模型建立在 Transwell 多孔滤膜上，滤膜上方接种牛脑内皮细胞，滤膜下方接种大鼠星形胶质细胞，形成非接触式共培养体系。培养分为两个阶段：前三天在含肝素的 DMEM 完全培养基与星形胶质细胞条件培养基的混合液中培养；后三天改用不含碳酸氢钠的 DMEM 培养基，并补充 8-(4-CPT)-环磷酸腺苷（cAMP）、地塞米松、RO-20-1724 和 TES 缓冲液，以促进内皮细胞分化和屏障形成。实验第六天开始检测屏障特性。TEER 使用 EndOhm-12 电极杯和 Millicell-ERS 仪器测定；小分子通透性采用放射性同位素标记的示踪剂开展双向转运实验，包括 ³H-地高辛（digoxin）、³H-雌酮-3-硫酸盐（estrone-3-sulfate）和 ³H-依托泊苷（etoposide），并以 ¹⁴C-D-甘露醇作为细胞旁路通透性标志物。实验在振荡摇床上进行，分别在 30、60、90、120 和 150 分钟从接收室取样。转运体功能通过加入不同抑制剂进行评估：维拉帕米（verapamil）抑制 P-gp，Ko143 抑制 BCRP，MK 571 抑制 MRP，zosuquidar 作为特异性较强的 P-gp 抑制剂，reversan 则为 MRP-1 抑制剂。实验中还将抑制剂单独或联合加入两侧小室，以评估不同转运体对同一底物的相对贡献。除功能检测外，作者还采用免疫细胞化学方法检测了 P-gp、BCRP 和 MRP-1 在新鲜分离的脑微血管及共培养内皮细胞中的表达情况。数据分析中，先对取样后的稀释效应进行校正，再通过稳态斜率计算通量，并根据供体室浓度计算表观渗透系数（Papp）。外排比（efflux ratio）定义为脑到血方向（abluminal-to-luminal, A–L）与血到脑方向（luminal-to-abluminal, L–A）的 Papp 比值。

主要结果显示，该共培养模型在第六天的平均 TEER 达到 1177±101 Ω·cm²，单批次最低为 327±30 Ω·cm²，最高可达 2555±399 Ω·cm²。甘露醇的平均表观渗透率为 0.95±0.1×10⁻⁶ cm·s⁻¹。在转运实验过程中，使用原培养基的模型 TEER 在前 60 分钟保持稳定，此后逐步下降，至 150 分钟时约降至 593 Ω·cm²；但甘露醇通量在整个实验期间保持稳定，说明细胞旁路通透性并未随 TEER 后期下降而显著改变。若将培养基更换为含 HEPES 的 HBSS，则 TEER 立即下降约 50%，因此后续实验均直接在原培养基中进行。双向转运实验中，地高辛的 L–A 和 A–L 渗透率分别为 2.0±0.2×10⁻⁶ 和 4.5±0.3×10⁻⁶ cm·s⁻¹，外排比为 2.5±0.2；加入维拉帕米后外排比降为 1.1±0.08。雌酮-3-硫酸盐的 L–A 和 A–L 渗透率分别为 0.62±0.1×10⁻⁶ 和 2.2±0.1×10⁻⁶ cm·s⁻¹，外排比为 4.4±0.5；加入 Ko143 后降为 1.4±0.2。依托泊苷的 L–A 和 A–L 渗透率分别为 0.66±0.06×10⁻⁶ 和 1.5±0.2×10⁻⁶ cm·s⁻¹，外排比为 2.4±0.1；加入 zosuquidar 与 reversan 后降为 1.5±0.1。对照甘露醇的外排比为 1.2±0.1，显著低于三种底物的基础外排比，而与加入抑制剂后的外排比无显著差异。进一步的 A–L 方向抑制剂实验中，地高辛可被维拉帕米、zosuquidar、reversan 及 zosuquidar 与 reversan 联合显著抑制，而 Ko143 和 MK 571 无显著作用，说明地高辛主要由 P-gp 介导外排。雌酮-3-硫酸盐的 A–L 转运受所有抑制剂不同程度抑制，其中 zosuquidar 的抑制程度最低，而 Ko143、MK 571 和 reversan 单独抑制程度相近；BCRP 与 MRP 抑制剂联用时抑制最明显，表明 BCRP 和 MRP 均参与其外排，P-gp 贡献较小。依托泊苷的 A–L 转运可被 zosuquidar、reversan、MK 571 及 zosuquidar 与 reversan 联合抑制，而 Ko143、维拉帕米无效，说明其主要经 P-gp 和 MRP 外排。免疫细胞化学结果显示，在新分离的牛脑微血管和共培养六天的内皮细胞中均可检测到 P-gp、BCRP 和 MRP-1 的表达。P-gp 呈弥漫性分布，MRP-1 也较弥散，BCRP 则在细胞间连接处有一定富集趋势。从 x,z 维度观察，P-gp 似乎在管腔膜侧表达更明显，但由于内皮细胞较薄、分辨率有限，BCRP 和 MRP-1 的精确定位较难判断。

综合来看，本研究证实了该牛内皮/大鼠星形胶质细胞共培养模型能够形成高电阻屏障，并在功能上表达 P-gp、BCRP 和至少一种 MRP 亚型。这些转运体能够驱动底物从脑侧向血液侧发生净外排，产生超过 2 的外排比。由于该模型兼具高 TEER、低细胞旁路通量和较为稳定的转运窗口，因此适用于小分子化合物的 BBB 通透性及外排转运体亲和性评估。

本研究的亮点在于：其一，模型 TEER 常超过 1000 Ω·cm²，显著高于多数既往牛脑内皮模型，有利于显现极性转运；其二，实验中采用多个结构不同、选择性相对明确的抑制剂组合，尝试区分 P-gp、BCRP 和 MRP 的贡献；其三，研究不仅停留在功能层面，还结合免疫细胞化学验证了转运体的表达；其四，作者强调在转运实验过程中不宜将培养基更换为常规的 HBSS 缓冲液，否则会显著削弱屏障电阻，这一操作细节对同类研究具有借鉴意义。该研究为中枢神经系统药物研发早期的血脑屏障渗透性体外筛选提供了一个更具屏障生理特征和转运活性的细胞模型依据。