本研究由杨涛（Tao Yang）、黄永新（Yongxin Huang）、李文静（Wenjing Li）、秦玲玲（Lingling Qin）、吴悠（You Wu）、吴丽丽（Lili Wu）和刘铜华（Tonghua Liu）等人完成。研究团队主要来自北京中医药大学东方医院和北京中医药大学教育部养生重点实验室，以及浙江中医药大学宁波市中医院。通讯作者为吴丽丽（qingniao_566@163.com）和刘铜华（thliu@vip.163.com）。该研究于2025年发表于 *Journal of Diabetes Research*，文章编号为6568591，共17页，属于开放获取（open access）论文。研究受国家自然科学青年基金（82004338）资助。
糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）的主要病因之一，全球范围内有超过7亿人受CKD影响。国际糖尿病联盟2021年报告显示，全球约5.37亿糖尿病患者，预计到2045年将增至7.83亿。DN的典型病理特征包括系膜细胞增生肥大、细胞外基质异常积聚、肾小球基底膜增厚以及Kimmelstiel–Wilson结节形成。其中，足细胞（podocyte）损伤被认为是DN蛋白尿发生发展的核心病理机制。足细胞是终末分化细胞，与血管内皮细胞和肾小球基底膜共同构成肾小球血液滤过屏障，其结构完整性和功能对维持滤过屏障至关重要。在糖尿病代谢异常环境下，足细胞发生形态和功能异常，包括足突增宽、融合、肥大及足细胞相关蛋白的表达异常，最终导致足细胞凋亡和脱落，引发蛋白尿和终末期肾病。
在分子机制层面，胰岛素信号通路的异常在足细胞损伤和DN发生中发挥重要作用。SHIP2（含Src同源2结构域的肌醇多磷酸5-磷酸酶2）是胰岛素信号通路的负调控因子，通过其5′-磷酸酶活性将PIP3水解为PIP2，从而抑制PI3K/AKT下游信号通路的激活。已有研究表明，在db/db小鼠中抑制肝脏特异性SHIP2过表达可改善葡萄糖代谢和胰岛素抵抗；CD2AP蛋白通过结合SHIP2负调控胰岛素信号通路并参与代谢紊乱；二甲双胍可通过降低SHIP2活性发挥肾脏保护作用。因此，SHIP2在足细胞胰岛素敏感性调控中具有关键抑制作用。
糖耐康（Tangnaikang, TNK）是临床经验方，由人参、夏枯草、女贞子、番石榴叶和三白草按1:4:2:4:2比例组成，具有清热散结、益气养阴的功效，已获国家专利（专利号ZL02153751.8）。前期研究显示TNK能调节糖尿病小鼠糖脂代谢、改善胰岛素敏感性、促进胰岛细胞修复再生、减少尿蛋白、抑制肾脏纤维化等，但其对足细胞损伤的作用机制尚不清楚。因此，本研究旨在利用db/db小鼠和高糖诱导的MPC5细胞模型，探讨TNK通过调控SHIP2/PI3K/AKT通路减轻DN足细胞损伤的保护机制。
本研究包含多个层面的实验程序，系统地从化学成分分析、网络药理学预测到体内动物实验和体外细胞实验，形成了完整的研究链条。
第一，化学成分鉴定。 研究采用超高效液相色谱–四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）对TNK方剂及含药血清进行化学成分分析。取0.5g TNK样品过4号筛，加入10mL 50%甲醇溶液，超声提取（100W，40kHz）30分钟，过滤后进样分析。数据显示，TNK方剂共鉴定出69种化合物，按药材来源分属：人参12种、三白草12种、女贞子24种、夏枯草24种、番石榴叶13种。化合物类型包括黄酮类、黄酮苷类、环烯醚萜苷类、三萜类、三萜皂苷类、木脂素类、苯乙醇苷类和不饱和脂肪酸等。对TNK含药血清的分析共鉴定出34种化合物，其中包括9个TNK原型成分和25个代谢产物，如柠檬苦素酸、没食子酸、红景天苷、松属素、三白草酮和原人参三醇等。数据分析使用Analyst TF 1.7.1软件采集，PeakView 1.2软件处理，通过与天然产物高分辨MS/MS谱库比对，并结合保留时间、质荷比、加合离子、同位素信息及二级质谱碎片信息进行成分鉴定。
第二，网络药理学分析。 通过PubChem数据库获取TNK化学成分的结构信息，利用SuperPred在线对接模拟工具预测药物靶点（筛选条件为概率≥0.7）。从OMIM、DisGeNET和GeneCards数据库检索与“diabetic nephropathy”相关的疾病蛋白，共获得4948个DN相关靶点，识别出1033个药物相关靶点。Venn分析显示药物成分与DN之间存在553个潜在交互靶点。蛋白质–蛋白质相互作用（PPI）网络分析表明PIK3R1和PIK3CA是TNK的核心靶点。KEGG富集分析显示PI3K-AKT信号通路是TNK作用的主要靶通路之一。网络构建使用Cytoscape 3.9.1，PPI网络使用STRING数据库（置信度阈值≥0.9），GO功能注释使用DAVID数据库（FDR<0.05，n≥3）。
第三，体内动物实验。 实验使用48只11周龄雄性C57BLKS/J-leprdb/leprdb（db/db）小鼠和12只同周龄C57BLKS/J-leprdb/+（db/m）小鼠。经1周适应期后，以非空腹血糖>13.9mmol/L为DN模型验证标准。db/db小鼠随机分为模型组、阳性对照组（二甲双胍0.25g/kg/天）、TNK低剂量组（1.14g/kg/天）和TNK高剂量组（4.56g/kg/天），db/m小鼠作为正常组。灌胃给药每日一次，持续8周。每2周测量体重和空腹血糖，每4周收集24小时尿液进行尿蛋白分析。干预结束后，检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、血尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）、晚期糖基化终末产物（AGEs）和β2-微球蛋白（β2-MG）水平。肾脏组织进行H&E染色、PAS染色和电子显微镜超微结构观察。同时，通过RT-qPCR、多重免疫荧光染色和Western blotting检测足细胞相关蛋白（synpo、nephrin、CD2AP、podocin）和PI3K/AKT通路蛋白（PI3K、AKT、SHIP2、IRS2、GLUT4）的表达水平。RT-qPCR使用β-actin作为内参，采用2^(-ΔΔCT)法计算相对表达量。多重免疫荧光使用特异性一抗（PI3K、AKT、synpo、nephrin、CD2AP、SHIP2、podocin、IRS2、GLUT4），经HRP标记二抗和荧光TSA染料（IF440、IF488、IF546、IF594、IF700）依次标记，DAPI复染核，使用QuPath软件（0.6.0版本）对肾小球阳性细胞百分比进行定量分析。
另外，为制备含药血清，30只SD大鼠（200–250g）以2.28g/kg/天的剂量灌胃TNK，持续7天。末次给药后2小时经戊巴比妥钠（45mg/kg）腹腔麻醉，腹主动脉取血，4°C、3000rpm离心15分钟分离血清，-20°C冻存备用。
第四，体外细胞实验。 MPC5细胞（FH1009，上海富衡生物）培养于DMEM完全培养基。细胞在低糖DMEM（5.5mmol/L）中传代至少4次以上以获得稳定分化的成熟足细胞。CCK-8法确定合适的含药血清浓度后，将细胞分为正常组（5.5mmol/L葡萄糖）、模型组（25mmol/L葡萄糖）、TNK低剂量含药血清组（25mmol/L葡萄糖+5%TNK含药血清，TNK-L）和TNK高剂量含药血清组（25mmol/L葡萄糖+20%TNK含药血清，TNK-H）。以1×10⁴细胞/孔接种于96孔板，低血清DMEM（2%FBS）培养18–24小时后，换用无血清低糖DMEM同步化12小时。除正常组外，其余各组以高糖（25mmol/L）刺激，TNK组给予含药血清干预24小时。随后以CCK-8法检测细胞活力，每孔加入10%CCK-8试剂，避光孵育40分钟，450nm波长检测吸光度，每组设6个复孔，实验重复3次。此外，设置LY294002（3μmol/L）作为PI3K/AKT通路阻断剂，分为TNK-L+LY和TNK-H+LY组。多重免疫荧光检测SHIP2、CD2AP、podocin、synpo、nephrin、p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT蛋白表达，Western blotting检测p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、synpo、nephrin和SHIP2蛋白水平，以β-actin为内参，使用Image Lab软件（6.1版本）进行相对定量。
化学成分与网络药理学结果： UPLC-Q-TOF/MS鉴定TNK方剂含69种化合物，含药血清含34种成分（9种原型+25种代谢物）。网络药理学识别出553个药物-疾病共同靶点，PPI网络显示PIK3R1和PIK3CA是核心靶点，KEGG富集分析表明PI3K/AKT通路与TNK作用显著相关。这一结果将TNK的潜在作用机制指向了胰岛素信号通路。
体内药效学结果： 与模型组相比，TNK组血清AGEs水平显著降低（p<0.01），表明糖代谢改善。模型组TC、TG、LDL显著高于正常组（p<0.01），TNK组LDL水平较模型组显著降低（p<0.01），HDL水平有所升高但无统计学意义。在8周干预期间，模型组24小时尿蛋白逐渐升高，TNK组和阳性对照组尿蛋白水平较模型组显著降低（p<0.01）。模型组血清BUN、SCr和β2-MG显著升高（p<0.01），TNK组BUN和β2-MG水平较模型组显著降低（p<0.01），表明肾功能改善。H&E和PAS染色显示模型组肾小球体积增大、基底膜增厚、系膜扩张、肾小管结构紊乱、间质水肿和炎性细胞浸润；TNK-H组肾小球体积明显缩小，结构更完整，基底膜增厚减轻，炎性浸润减少。电镜观察显示正常组足细胞足突呈栅栏状排列，紧密贴附于毛细血管基底膜外表面；模型组足突节段性消失融合；TNK-H组足突节段性消失和融合显著减少。这些结果证实TNK能有效改善db/db小鼠的肾脏结构和功能。
机制验证结果： RT-qPCR结果显示，与正常组相比，模型组CD2AP和nephrin mRNA表达显著降低，SHIP2 mRNA表达显著升高（p<0.01）。TNK组CD2AP和nephrin mRNA表达较模型组显著升高（p<0.01），SHIP2 mRNA表达显著降低（p<0.01）。此外，TNK组PIK3CG、AKT1、AKT2、IRS2和GLUT4的mRNA表达水平较模型组显著降低（p<0.01）。多重免疫荧光结果显示，模型组肾小球SHIP2表达显著升高，而CD2AP、podocin、synpo和nephrin蛋白表达显著降低（p<0.01）；TNK组SHIP2表达显著降低（p<0.01），PI3K、AKT、IRS2和GLUT4蛋白表达在TNK-H组显著升高（p<0.01）。
体外实验结果： CCK-8法显示TNK含药血清在24小时后显著提高高糖诱导的MPC5细胞活力（p<0.01）。多重免疫荧光显示模型组SHIP2表达显著升高，CD2AP、podocin、synpo和nephrin表达显著降低（p<0.01）；TNK-H+LY组SHIP2表达显著降低，而CD2AP、podocin、synpo和nephrin表达较模型组显著升高（p<0.01）。Western blotting证实TNK-H组SHIP2表达显著低于模型组（p<0.01），synpo和nephrin蛋白表达显著升高（p<0.01），p-PI3K表达显著升高（p<0.01）。这些结果说明TNK含药血清通过抑制SHIP2、激活PI3K/AKT通路，发挥对高糖诱导足细胞损伤的保护作用。
本研究得出以下结论：TNK方剂能改善db/db小鼠的糖脂代谢紊乱以及肾脏结构和功能，降低24小时尿蛋白水平，改善肾小球结构，显著减少足细胞足突的节段性消失和融合。TNK通过下调SHIP2表达、激活PI3K/AKT信号通路，上调足细胞相关蛋白（CD2AP、podocin、synpo、nephrin）和通路蛋白（PI3K、AKT、IRS2、GLUT4）的表达，从而减轻DN足细胞损伤。体外实验证实TNK含药血清可通过抑制SHIP2、增强PI3K/AKT通路活性来保护高糖诱导的MPC5细胞。
本研究的科学价值在于揭示了TNK治疗DN的新机制——通过SHIP2/PI3K/AKT通路调节足细胞胰岛素敏感性。SHIP2作为胰岛素信号负调控因子，其与TNK的关系此前未被报道，本研究通过网络药理学与实验验证相结合的策略建立了这一关联。应用价值方面，TNK作为已获国家专利的临床经验方，本研究为其在DN治疗中的应用提供了实验依据，尤其为中药复方通过多成分、多靶点调控胰岛素信号通路改善足细胞损伤提供了新思路。研究采用的UPLC-Q-TOF/MS血清药物化学分析与网络药理学预测相结合的方法，也为中药复方研究提供了可借鉴的技术路线。
本研究的主要亮点包括：第一，首次将SHIP2纳入TNK治疗DN的机制框架，拓展了对TNK多靶点作用的理解。第二，系统性地将药物化学分析、网络药理学预测、体内db/db小鼠模型和体外高糖诱导MPC5细胞模型整合，形成了从成分到靶点再到功能验证的完整证据链。第三，采用多重免疫荧光技术在同一组织切片或细胞爬片上同时检测多达9种蛋白的表达，实现了对通路上下游分子的同步可视化定量。
研究也存在若干局限。在体内实验中，缺乏SHIP2基因敲除小鼠的机制验证；在体外实验中，未建立SHIP2基因转染足细胞模型。因此，当前证据只能提示TNK的保护作用与PI3K/AKT通路和SHIP2因子的关联性，尚不能构成完整的因果性证据。此外，RT-qPCR实验中针对PIK3CA和PIK3CB亚型的引物扩增失败，导致相关结果未能报告。研究团队指出，未来需要更多实验以确证深入的分子机制。