运动通过M2型乙酰胆碱受体调节内质网应激和线粒体自噬减轻心肌缺血再灌注损伤
研究报告
一、研究概况
本项研究由陕西师范大学体育学院运动与运动生物学研究所的王友华教授团队主导，第一作者为陈伟和梅梅，合作单位包括陕西理工大学教育科学学院、复旦大学生理学与病理生理学系以及青岛大学康复科学与健康科学学院。该原创性研究成果于2024年正式发表于国际知名期刊《Antioxidants & Redox Signaling》（抗氧化剂与氧化还原信号）第40卷第4至6期，页码范围为209至221页。
二、研究背景与目的
急性心肌梗死是导致全球人口发病率和死亡率居高不下的主要原因之一。目前，临床上针对急性心肌梗死的标准治疗策略是再灌注治疗。然而，恢复血流灌注本身可能引发一种矛盾性的心肌细胞功能障碍，即心肌缺血再灌注损伤。这种损伤的病理机制极为复杂，目前认为主要与心肌细胞内氧化应激水平升高、内质网应激的过度激活、心肌线粒体结构与功能的异常改变，以及心肌细胞的凋亡密切相关。因此，寻找能够有效减轻再灌注损伤的方法和手段具有极其重要的临床意义。
在心血管疾病，特别是急性心肌梗死后，心脏自主神经功能通常会发生紊乱，表现为副交感神经（迷走神经）活性减弱和交感神经过度兴奋。已有研究表明，刺激迷走神经能够减轻缺血再灌注损伤，对心肌产生保护作用。M2型乙酰胆碱受体是心肌细胞上大量存在的一种毒蕈碱型乙酰胆碱受体，作为副交感神经系统的主要效应受体，它与心血管疾病的发展密切相关，并在抑制内质网应激诱导的细胞凋亡以及调节线粒体自噬方面发挥着关键作用。另一方面，运动训练作为一种非药物干预手段，已被证实能够诱导心脏产生适应性改变，包括调节自主神经功能障碍、降低氧化应激、改善钙稳态和抑制内质网应激，从而降低心血管疾病的风险。
然而，运动是否能够通过M2型乙酰胆碱受体这一关键靶点来调节内质网应激和线粒体自噬，从而抵抗心肌缺血再灌注损伤，其具体机制尚不清楚。基于此，本研究旨在探讨运动是否能够通过M2型乙酰胆碱受体调节内质网应激和线粒体自噬，以抵抗心肌缺血再灌注损伤，并阐明其潜在的作用机制。
三、研究设计与方法
研究团队设计了严谨的动物和细胞实验来验证假设。整个研究流程可分为三个主要部分：动物模型建立与运动干预、细胞模型建立与药物干预，以及后续的多层次指标检测。
（一）动物实验部分
研究对象为三个月大的雄性Sprague Dawley大鼠，由西安交通大学实验动物中心提供。实验程序遵循实验动物护理和使用指南，并获得了陕西师范大学伦理委员会的批准。大鼠被随机分为五个组：假手术组（S组，n=11）、缺血再灌注模型组（I/R组，n=9）、运动+缺血再灌注组（EI/R组，n=10）、胆碱+缺血再灌注组（CI/R组，n=11）以及美索曲明+运动+缺血再灌注组（EMI/R组，n=8）。
其中，EI/R组和EMI/R组的大鼠接受了为期8周的跑台有氧运动训练，每周进行5天。训练方案为：起始以10米/分钟的速率进行20分钟的适应性训练；一周后，速率提高至15米/分钟，训练时长为35分钟；此后，在保持速率恒定的情况下，每两天增加5分钟训练时间，直至达到每日60分钟；之后再将速率提升至20米/分钟，并保持每日60分钟的恒定训练方案直至结束。此方案旨在将大鼠的最大摄氧量维持在60%至75%之间。
8周运动干预结束后，对除假手术组外的所有组别大鼠建立心肌缺血再灌注模型。方法为通过手术结扎冠状动脉的左前降支，造成30分钟的缺血状态，随后松开结扎线进行4小时的再灌注。假手术组仅进行开胸和缝合，不结扎血管。在诱导缺血前5分钟，CI/R组大鼠通过右颈静脉注射胆碱（一种副交感神经激动剂，5 mg/kg），EMI/R组则注射美索曲明（M2型乙酰胆碱受体抑制剂，500 ng/kg）。实验过程中，利用PowerLab多导生理记录仪持续监测左心室功能。实验结束后收集大鼠的血清、左心室组织样本，一部分在液氮中速冻用于分子生物学分析，另一部分用4%甲醛固定用于组织学分析。
（二）细胞实验部分
为在体外验证机制，研究使用了H9c2大鼠胚胎心肌细胞系。首先，通过设置不同的缺氧时间（4、6、8、12、24小时）后再复氧4小时，筛选最佳的缺氧/复氧模型时间点，结果发现缺氧12小时/复氧4小时造成的损伤最为明显，故以此作为细胞模型。随后，在此模型基础上，研究者分别使用了5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸（AICAR，一种运动模拟剂，1 mM）、胆碱（0.5 mM）以及美索曲明（1 μM）进行干预，以观察它们在缺氧/复氧条件下对内质网应激的影响。
（三）指标检测与分析流程
研究团队运用了多种技术手段，从整体功能、组织形态、亚细胞超微结构到蛋白分子表达进行了多层次的分析。
四、主要研究结果
（一）运动通过M2型乙酰胆碱受体改善I/R大鼠的心脏自主神经功能障碍。 研究结果显示，与假手术组相比，I/R组大鼠的心率变异性指标显示其处于副交感神经活性降低而交感神经过度兴奋的失衡状态。而8周有氧运动（EI/R组）或胆碱干预（CI/R组）能够显著逆转这种失衡，表现为高频功率升高和低频/高频比值降低，这与增强副交感神经活性一致。同时，运动也可上调心肌中M2型乙酰胆碱受体的蛋白表达。当使用M2型乙酰胆碱受体抑制剂美索曲明后，运动的这些保护效应被部分抵消，表现为交感神经活性的相关指标再次升高，M2型乙酰胆碱受体蛋白表达下降。
（二）运动通过M2型乙酰胆碱受体减轻I/R大鼠的心肌损伤并改善心脏功能。 血流动力学检测表明，I/R导致大鼠左心室收缩压和-dp/dt显著降低，左心室舒张末期压显著升高，心脏功能严重受损。运动或胆碱干预能显著提升心脏收缩和舒张功能。组织学染色显示，运动能减少I/R引起的心肌胶原纤维沉积和微观结构损伤。血清学检查也证实，运动能够降低心肌损伤标志物肌酸激酶和乳酸脱氢酶的水平。然而，这些在EI/R组中观察到的保护效应，在EMI/R组（提前注射抑制剂）中均有所减弱。这有力地说明，运动减轻心肌I/R损伤的作用是部分通过M2型乙酰胆碱受体实现的。
（三）运动通过M2型乙酰胆碱受体抑制I/R大鼠的心肌线粒体自噬。 透射电镜观察发现，I/R组大鼠心肌肌原纤维断裂、线粒体肿胀、嵴断裂溶解。运动干预显著减轻了这些线粒体超微结构的损伤。蛋白质印迹结果进一步揭示，I/R导致线粒体动力学失衡，表现为融合蛋白MFN2表达下调而分裂蛋白DRP1表达上调。同时，I/R激活了PINK1/Parkin介导的线粒体自噬通路，表现为PINK1、Parkin、LC3II和BNIP3蛋白表达显著升高，而自噬底物p62蛋白表达显著降低。运动干预和胆碱处理能够逆转上述所有蛋白的表达趋势，促进线粒体融合，抑制过度分裂和自噬。当M2型乙酰胆碱受体被抑制后，运动对线粒体动力学和自噬的调节作用也部分消失。这表明有氧运动通过M2型乙酰胆碱受体，促进心肌线粒体融合与分裂的平衡，并抑制过度的线粒体自噬。
（四）运动通过M2型乙酰胆碱受体抑制I/R大鼠的内质网应激。 在I/R大鼠心肌中，内质网应激标志蛋白GRP78和GRP94的表达显著升高，其下游的PERK/eIF2α/ATF4信号通路被显著激活，表现为PERK、eIF2α和ATF4的磷酸化水平增高。运动或胆碱干预则能显著抑制这些蛋白的表达和该通路的磷酸化活性。同样，在使用了M2型乙酰胆碱受体抑制剂后，运动抑制内质网应激的效应大幅减弱。这些结果证实，有氧运动通过M2型乙酰胆碱受体，有效抑制了I/R大鼠心肌的过度内质网应激，并降低了PERK/eIF2α/ATF4通路的激活水平。
（五）运动通过M2型乙酰胆碱受体减少I/R大鼠的心肌细胞凋亡。 TUNEL染色结果显示，I/R组大鼠心肌中存在大量的凋亡细胞，而运动干预后凋亡细胞数量显著减少。与之相对应，内质网应激诱导凋亡的关键蛋白CHOP的表达在I/R组显著上调，而在运动组显著下调。当M2型乙酰胆碱受体被阻断后，运动减少凋亡细胞数量和下调CHOP蛋白表达的作用均被削弱。
（六）AICAR通过M2型乙酰胆碱受体抑制H9c2心肌细胞的缺氧/复氧诱导的内质网应激。 在体外细胞实验中，缺氧12小时/复氧4小时导致H9c2心肌细胞的内质网应激水平显著升高，PERK/eIF2α/ATF4通路被激活。使用运动模拟剂AICAR或胆碱处理，均能有效降低内质网应激并抑制该通路的磷酸化水平，这模拟了体内运动的效果。然而，当同时使用M2型乙酰胆碱受体抑制剂美索曲明时，AICAR的保护作用被部分取消。这一结果在细胞层面进一步验证了运动模拟剂可以通过激活M2型乙酰胆碱受体，来抑制PERK/eIF2α/ATF4信号通路，从而减轻缺氧/复氧诱导的内质网应激。
五、研究结论与价值
本研究系统性地阐明了一条运动保护心肌缺血再灌注损伤的新机制：有氧运动能够激活副交感神经功能，通过介导心肌细胞上的M2型乙酰胆碱受体，同时发挥对PINK/Parkin介导的线粒体自噬通路和PERK/eIF2α/ATF4介导的内质网应激通路的双重抑制作用，进而有效减少心肌细胞凋亡，最终减轻由缺血再灌注引起的急性心肌损伤，改善心脏功能。
这项研究的科学价值在于，它首次将运动、副交感神经递质受体（M2型乙酰胆碱受体）、内质网应激以及线粒体自噬这几个关键要素联系起来，构建了一个完整的保护通路，为运动的心脏保护作用提供了新的分子机制解释。其应用价值在于，它为非药物疗法（特别是适度运动）在心血管疾病一级和二级预防中的核心地位提供了强有力的理论支持，并提示M2型乙酰胆碱受体及其下游信号通路可能成为未来研发防治心肌缺血再灌注损伤新药的潜在靶点。
六、研究亮点
（一）机制创新性强：本研究创新性地揭示了M2型乙酰胆碱受体是运动减轻心肌缺血再灌注损伤的关键分子靶点，阐明了其通过协调抑制“内质网应激”和“线粒体自噬”这两条关键病理通路的双重保护机制。 （二）研究设计完善：研究从整体动物、组织、细胞、超微结构和分子蛋白等多个层次，并采用了功能、形态和生化指标相结合的方式进行了全方位的验证。使用了M2型乙酰胆碱受体激动剂（胆碱）和特异性抑制剂（美索曲明）作为工具药，从正反两个方面严谨地论证了M2型乙酰胆碱受体的核心作用，并将体内运动实验与体外细胞模拟实验（使用AICAR）的结果相互印证，逻辑链条完整，证据强度高。 （三）研究意义深远：研究结果为运动康复处方在心脏病患者中的精准应用提供了新的科学依据，并为开发模拟运动效应或靶向M2型乙酰胆碱受体的新型心脏保护药物开辟了新的思路，具有重要的转化医学潜力。