本研究由Elvira Mennillo（意大利比萨大学兽医科学系）、Francesca Cappelli（挪威科技大学[NTNU]生物学系）和Augustine Arukwe（通讯作者，挪威科技大学生物学系）合作完成，发表于2019年4月的《Toxicology and Applied Pharmacology》期刊（Volume 371, pp. 84-94）。研究聚焦于环境毒理学领域，探讨四种有机磷酸酯（Organophosphate Esters, OPEFRs）对H4IIE大鼠肝癌细胞系的毒性作用机制，重点关注生物转化（biotransformation）和氧化应激（oxidative stress）响应。

学术背景

有机磷酸酯（OPEs）作为多溴联苯醚（PBDEs）的替代阻燃剂被广泛应用，但其结构与有机磷农药相似，可能对环境和健康构成潜在风险。OPEs可通过挥发、磨损进入水体，已在全球水体、沉积物及人体尿液中检出（如TBOEP在自来水中浓度达85.1–325 ng/L）。既往研究表明，部分OPEs（如TCEP）具有致癌性，TBP和TPP可能引发神经毒性。然而，其细胞毒性机制尚不明确。本研究旨在通过体外实验，评估TBP、TBOEP、TCEP和TPP对肝细胞的毒性效应，揭示其通过生物转化酶（如CYP1A1）和抗氧化系统（如GPx、CAT）的作用路径。

研究流程

1. 细胞培养与暴露实验

使用H4IIE大鼠肝癌细胞系（源自Reuber H-35细胞），培养于含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基中。细胞暴露于0（对照）、1、50、100和200 μM浓度的四种OPEs（TBP、TBOEP、TCEP、TPP）48小时。TPP因疏水性需用丙酮溶解（终浓度<0.001%）。

2. 细胞毒性检测（MTT法）

通过MTT还原实验评估线粒体活性。细胞接种于96孔板（2×10^4/孔），暴露后与MTT孵育4小时，DMSO溶解甲臜晶体，测定570 nm吸光度。计算IC50值（仅TBP和TBOEP可计算）。

3. 生物转化响应分析

• 基因表达：qPCR检测CYP1A1 mRNA水平，引物序列见表1。
  
• 酶活性：
  
  • EROD（乙氧基试卤灵-O-脱乙基酶）和MROD（甲氧基试卤灵-O-脱乙基酶）活性反映CYP1A1功能。细胞与NADPH及底物（7-乙氧基/甲氧基试卤灵）反应20分钟，荧光法测定（激发535 nm/发射590 nm）。
    

4. 氧化应激指标检测

• 基因表达：qPCR分析GPx1、GR、GSTA2、CAT的mRNA水平。
  
• 酶活性：
  
  • GPx：以NADPH氧化速率（340 nm）评估，使用叔丁基过氧化氢启动反应。
    
  • GR：NADPH氧化法测定。
    
  • GST：以CDNB为底物，340 nm检测谷胱甘肽结合活性。
    
  • CAT：过氧化氢-甲醇体系，Purpald显色测定540 nm吸光度。
    

5. 数据分析

使用GraphPad Prism 6.01进行单因素ANOVA和Dunnett多重比较检验，Pearson相关性分析评估剂量依赖性。

主要结果

1. 细胞毒性

• MTT实验显示，TBP和TBOEP呈剂量依赖性降低细胞活性（IC50分别为177.6 μM和170.9 μM），200 μM时TBOEP几乎完全抑制存活率。TCEP和TPP在200 μM时存活率低于50%，但无显著剂量相关性。
  

2. 生物转化响应

• TBP/TBOEP：显著上调CYP1A1 mRNA（50–100 μM），MROD活性同步增加（TBP在50 μM升高50%）。
  
• TCEP：CYP1A1 mRNA显著升高（1–100 μM），但EROD/MROD活性下降，提示酶功能抑制。
  
• TPP：无mRNA变化，但酶活性在低浓度（1–50 μM）显著降低，显示转录与翻译解耦联。
  

3. 氧化应激响应

• TBP/TBOEP：显著诱导GPx1（100 μM时mRNA升高2倍）、GR和GSTA2表达，GST活性与TBP剂量正相关（r²=0.99）。
  
• TCEP：CAT mRNA（50–100 μM）和活性（1–100 μM）显著升高，但GPx活性波动。
  
• TPP：仅100 μM时GR和CAT mRNA轻微上调，酶活性无变化。
  

结论与价值

1. 毒性机制差异：非卤化OPEs（TBP/TBOEP）通过CYP1A1介导快速代谢，而卤化OPEs（TCEP）可能因氯代侧链干扰酶功能。
   
2. 氧化应激路径：TBP/TBOEP依赖谷胱甘肽系统（GPx/GR/GST），TCEP依赖CAT清除过氧化物，TPP毒性最弱。
   
3. 环境健康意义：OPEs在食品包装等领域的残留（如∑OPEs达132 ng/g湿重）提示需关注其长期低剂量暴露风险。
   

研究亮点

• 创新方法：首次整合CYP1A1转录/酶活双维度评估OPEs代谢差异。
  
• 毒性分级：明确TBOEP > TBP > TCEP > TPP的毒性序列，为优先管控提供依据。
  
• 应用价值：为制定OPEs的食品安全标准（如EDI评估）提供毒理学基础。
  

其他发现

• 剂量悖论：TCEP在1 μM抑制GPx活性，100 μM却激活，提示低浓度可能干扰抗氧化防御。
  
• 技术细节：使用Synergy HT微孔板读数仪同步检测多指标，提升数据一致性。
  

本研究系统揭示了OPEs的细胞毒性机制差异，为环境风险评估和替代品开发提供了关键科学依据。