一项基于尿液液体活检的上尿路尿路上皮癌检测方法研究

主要作者来自中国人民解放军总医院第一医学中心泌尿外科，通讯作者为Xu Zhang和Hongzhao Li，第一作者包括Yansheng Xu、Xin Ma、Xing Ai、Jiangping Gao和Yiming Liang。该研究发表于Frontiers in Oncology，于2021年2月9日在线发表。

上尿路尿路上皮癌（upper tract urinary carcinoma，UTUC）包括肾盂癌和输尿管癌，约占尿路上皮癌的5%。目前临床常用的诊断手段如计算机断层扫描（CT）、尿脱落细胞学检查和输尿管镜检查均存在明显不足：CT和尿脱落细胞学敏感性较低，而输尿管镜检查作为术前获取病理的金标准，属于侵入性操作，可能引起感染、出血、肿瘤细胞种植播散等并发症。既往研究中，基于基因突变组合或基因甲基化组合的尿液活检方法在UTUC诊断中未显示出令人满意的敏感性和特异性。因此，临床迫切需要一种高灵敏、非侵入性的UTUC诊断方法。本研究首次将表观遗传学生物标志物ONECUT2甲基化检测应用于UTUC诊断，并与17个基因的高通量测序相结合，构建了基于逻辑回归的预测模型，用于评估血尿患者的UTUC风险。

本研究为双盲、前瞻性临床试验，于2017年启动。2017年10月至2018年5月期间，从中国人民解放军总医院第一、第四和第七医学中心共入组161例有镜下或肉眼血尿的患者，其中69例经组织病理学确诊为恶性UTUC（UTUC+），92例经内镜、腹部超声、CT及磁共振成像（MRI）检查未发现恶性病变（UTUC−）。UTUC−组患者进行了约两年的随访以排除隐匿性肿瘤。采集每例患者50毫升首次晨尿，离心后收集细胞沉淀，经磷酸盐缓冲液洗涤后于−80°C保存备用。同时收集12例配对肿瘤组织样本用于验证。样本处理人员对患者临床数据设盲。最终150例尿液样本和11例组织样本通过质量控制进入后续分析。

检测流程包括三个主要环节。第一环节为基于扩增子的多重PCR高通量测序，针对既往研究中发现的UTUC高频驱动基因设计了17个基因的检测panel，包括TERT启动子、FGFR3、TP53、PIK3CA、HRAS、KRAS、ERBB2等热点突变区域，共38对引物。采用两轮富集策略构建测序文库，在Ion Proton平台上进行测序。生物信息学分析流程为：使用Bowtie2（版本2.2.4）将测序读段比对至hg19参考基因组，通过samtools（版本0.1.19）处理比对文件，利用自定义Perl脚本进行变异统计。变异判定标准为突变频率大于0.5%且支持的非重复读段数不少于20条。第二环节为ONECUT2基因CpG位点的甲基化分析。采用EZ DNA Methylation-Lightning™试剂盒对20纳克经亚硫酸氢盐转化的DNA进行实时荧光定量PCR检测，分别以FAM和VIC信号定量甲基化和非甲基化模板的Ct值，计算ΔCt值作为甲基化评分。第三环节为统计分析与模型构建。使用Python（版本3.6）的scipy（1.1.0）和scikit-learn（0.19.2）模块进行单因素逻辑回归分析，评估各临床因素和分子标志物与UTUC风险的相关性。将150例样本随机分为训练集108例和验证集42例，通过R包glmnet构建逻辑回归预测模型，惩罚参数alpha通过训练集内部10折交叉验证优化，最终优化值为0。

在尿液ctDNA与配对肿瘤组织的一致性分析中，12例配对组织样本中有11例通过质控。在9例UTUC+样本中共检出5个基因的14个变异，其中13个在尿液和组织中均为阳性，一致性为93%。1例组织未检出但尿液检出AKT1突变，提示尿液样本可作为组织基因分析的补充。2例UTUC−患者的尿液和组织均未检出突变。单因素逻辑回归分析显示，FGFR3突变、TERT启动子突变、TP53突变、ONECUT2甲基化以及年龄大于50岁均与UTUC风险显著相关，其中ONECUT2甲基化（ΔCt<7.93）的比值比为131.91，组套检测（≥1个基因突变或ONECUT2甲基化阳性）的比值比为133.17。FISH检测仅在80%的UTUC+患者和9%的UTUC−患者中开展，其敏感性为51%（26/51），特异性为100%（0/8）。

在基因突变单独应用时，17基因panel的敏感性为71.9%，特异性为95.4%，阳性预测值为92.0%，阴性预测值为82.0%，接近既往UTUC研究中仅用基因突变panel的敏感性（75%）。在不同临床亚组的突变分布比较中，TP53突变在高分级UTUC中显著高于低分级（31.9%对0%，p=0.0065），而FGFR3突变（47.1%对17.0%，p=0.0223）和PIK3CA突变（23.5%对2.1%，p=0.0155）在低分级中显著更高。此外，本研究首次在UTUC队列中发现TERT启动子突变在非肌层浸润组中显著高于肌层浸润组（72.7%对25.6%，p=0.0005），且HRAS突变在两组间也存在显著差异。

ONECUT2甲基化单独检测以ΔCt值7.93为最佳截断值时，受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.93，敏感性为89.1%（57/64），特异性为94.2%（81/86），阳性预测值为91.9%，阴性预测值为92.0%。这一表现优于既往报道的基于VIM、RASSF1A、GDF15和TMEFF2甲基化panel在UTUC中的敏感性82%和特异性62%。将ONECUT2甲基化与17基因突变检测组合为组套检测后，敏感性提升至92.2%，特异性为91.9%，阳性预测值为89.4%，阴性预测值为94.1%。

基于单因素分析中具有显著性的特征构建了4个逻辑回归模型：模型A包含年龄和ONECUT2甲基化，模型B包含年龄和17基因突变检测结果，模型C包含年龄和组套检测结果，模型D包含年龄、TERT启动子突变状态（C228T和C250T至少一个位点突变）和ONECUT2甲基化水平。训练集中模型A、B、C、D的AUC分别为0.953、0.903、0.947和0.957。以约登指数最高点为最佳截断值，模型D的敏感性为94.0%，特异性为93.1%，阳性预测值为92.2%，阴性预测值为94.7%。在验证集中，模型D的AUC为0.962。随访期间，1例初始诊断为输尿管炎症且组套检测中TERT、FGFR3、TP53、PIK3CA基因突变及ONECUT2甲基化均为阳性的患者，在入组17个月后被确诊为输尿管癌，提示尿液基因组学改变可能早于影像学改变。

本研究首次在UTUC诊断中应用ONECUT2甲基化这一表观遗传学生物标志物，证实其具有优越的诊断性能。将ONECUT2甲基化检测与17个基因高通量测序相结合，并利用逻辑回归模型整合年龄、TERT启动子突变状态和ONECUT2甲基化水平，可在血尿患者中有效评估UTUC风险。该组套的高阴性预测值有利于排除非UTUC患者，减少低风险患者接受广泛检查的必要性，降低医疗成本和患者不适，为泌尿外科医生在影像学和常规尿脱落细胞学之外提供了重要的辅助诊断工具。此外，基因突变检测结果还可能为UTUC患者的肿瘤分级和肌层浸润状态提供预测信息。研究团队指出，模型D仅需检测TERT启动子突变和ONECUT2甲基化即可达到与更广泛panel相近的预测性能，有望显著降低检测成本和时间，但该优化方案尚需在大规模前瞻性队列中验证。本研究也存在一定局限性，包括部分入组患者随访信息不完整、需要更大的多中心队列进行外部验证，以及是否可用于术后监测和预后预测仍需进一步探索。