关于铜暴露通过抑制Ras/PI3K/Akt信号通路诱导小鼠肝细胞G0/G1期周期停滞的研究报告
本文旨在向国内同行介绍由Huan Liu、Huidan Deng、Zhijie Jian、Hengmin Cui、Hongrui Guo、Jing Fang、Zhicai Zuo、Junliang Deng、Yinglun Li、Xun Wang、Ling Zhao、Yanqiu Zhu等研究人员共同完成的一项原创性研究成果。该项研究发表于2021年7月的《Ecotoxicology and Environmental Safety》期刊（卷222，文章号112518）。研究团队主要来自四川农业大学兽医学院，并得到四川省动物疾病与环境危害防控重点实验室等单位的支持。这是一项在环境毒理学和分子毒理学交叉领域的实验研究，旨在深入探究高剂量铜（Copper, Cu）暴露对小鼠肝细胞周期进程的具体影响及其背后的分子机制。
研究背景与目的 铜是生物体必需的微量金属元素，参与多种关键酶的构成和重要的生命过程。然而，过量的铜摄入具有毒性，可导致多种器官损伤，其中肝脏是铜毒性作用的主要靶器官，因为肝脏是铜吸收后沉积和代谢调控的主要场所。既往研究已证实，过量铜暴露可引起肝脏氧化应激、细胞凋亡和组织病变。细胞周期（Cell Cycle）是细胞增殖和DNA复制的核心过程，其异常停滞（Cell-Cycle Arrest, CCA）与细胞生长抑制、衰老乃至凋亡密切相关。尽管有研究表明铜暴露可引起小鼠脾脏、胸腺和肝脏的G0/G1期周期停滞，但其诱导肝细胞周期停滞的具体分子通路尚不完全清楚。特别是Ras/PI3K/Akt信号通路作为调控细胞增殖和G1/S期转换的关键促生长通路，其在铜诱导的肝细胞周期停滞中的作用机制有待阐明。因此，本研究旨在系统评估不同剂量铜暴露对小鼠肝细胞周期分布的影响，并重点从蛋白质和mRNA表达水平，探究Ras/PI3K/Akt信号通路及其下游关键因子在其中的作用，从而揭示铜抑制肝细胞增殖的潜在分子机制。
详细研究流程 本研究设计严谨，流程清晰，主要包括动物处理、病理学观察、细胞周期分析、以及蛋白与基因表达检测等多个环节，并运用了标准化的分子生物学技术。
1. 实验动物与处理 研究选用240只四周龄、健康状况良好的ICR（Institute of Cancer Research）小鼠（雌雄各半）。经过一周适应性饲养后，随机分为4组，每组60只。对照组每天灌胃给予蒸馏水；三个处理组分别灌胃给予浓度为4、8和16 mg/kg体重的铜溶液（以CuSO4形式）。所有处理均持续42天，每天一次。在处理期的第21天和第42天，分别处死各组中的8只小鼠（雌雄各半）以采集肝脏样本，用于后续各项检测。所有动物实验均遵循四川农业大学动物伦理委员会批准的指南进行。
2. 肝脏病理学观察 在实验第21天和第42天，采集的肝脏组织经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片（4 μm厚）后，进行苏木精-伊红（H&E）染色，随后在光学显微镜下进行组织病理学检查，评估铜暴露引起的肝组织损伤程度，如肝索排列紊乱、颗粒变性和空泡变性等，并进行半定量评分。
3. 流式细胞术分析细胞周期 同样在第21天和第42天，取新鲜肝脏制备单细胞悬液。细胞经冷PBS洗涤后，用0.25% Triton X-100透化，并用碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）染色。使用BD FACScalibur流式细胞仪检测细胞DNA含量，并通过FlowJo软件分析处于G0/G1期、S期和G2/M期的肝细胞百分比，以直观反映铜暴露对细胞周期分布的影响。
4. 细胞周期调控分子蛋白表达的Western Blot检测 在指定时间点，取肝脏组织提取总蛋白。使用BCA法测定蛋白浓度后，通过SDS-PAGE电泳分离蛋白，并转印至硝酸纤维素膜。膜经封闭后，与一系列特异性一抗孵育过夜，这些一抗靶向Ras/PI3K/Akt通路及细胞周期调控的关键蛋白，包括：Ras、PI3K、p-PI3K (Tyr458)、Akt、p-Akt (Thr308)、PTEN、p-PTEN、FoxO3a、p-FoxO3a (Ser253)、GSK-3β、p-GSK-3β (Ser9)、MDM2、p53、p-p53 (Ser15)、p27、p21、CDK2/4、p-CDK2以及Cyclin E/D。随后与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，采用ECL化学发光法显影，并使用ImageJ2x软件对条带灰度值进行定量分析，计算目标蛋白的相对表达量。
5. 细胞周期调控分子mRNA表达的实时定量PCR (qRT-PCR)检测 同期，取另一部分肝脏组织在液氮中研磨，使用RNAiso Plus试剂提取总RNA。利用Prim-script RT试剂盒将RNA反转录为cDNA。根据NCBI数据库中的基因序列（以β-actin为内参基因）设计特异性引物（论文中表1列出了所有引物序列），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用SYBR Premix Ex Taq II系统和Bio-Rad C1000热循环仪进行qRT-PCR扩增。最后采用2-ΔΔCt法计算目标基因（包括上述蛋白对应的编码基因）的相对mRNA表达水平。
6. 数据分析 所有定量数据均以均值±标准差表示。使用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析（ANOVA）。以P < 0.05和P < 0.01分别表示差异具有显著性和极显著性。
主要研究结果 研究结果显示，铜暴露以剂量和时间依赖性的方式对小鼠肝脏造成了显著影响，并从表型到分子机制层面提供了连贯的证据链。
1. 病理学损伤 组织病理学检查发现，对照组肝脏无异常病变。而铜处理组出现了不同程度的肝损伤：4 mg/kg组在21天时出现轻度空泡变性；8 mg/kg和16 mg/kg组在21天时出现明显的颗粒变性和空泡变性，并可见坏死肝细胞；至42天时，所有处理组的损伤均加剧，16 mg/kg组病变最为严重。评分结果（论文中表2）量化了肝索排列紊乱、肝细胞变性及坏死程度随铜剂量和暴露时间增加而加重的趋势，这为铜的肝脏毒性提供了形态学证据。
2. 肝细胞周期分布改变 流式细胞术结果（论文中图2）直接证实了铜暴露诱导了G0/G1期周期停滞。与对照组相比，8 mg/kg和16 mg/kg组在21天和42天时，处于G0/G1期的肝细胞百分比均显著增加（P < 0.05或P < 0.01），而处于G2/M期的细胞百分比则显著降低（P < 0.01）。4 mg/kg组在42天时也表现出相同的趋势。这表明，过量铜确实阻碍了肝细胞从G1期间S期的正常进程，导致细胞聚集在G0/G1期。
3. 细胞周期引擎分子CDK2/4和Cyclin E/D表达下调 为了探究周期停滞的直接原因，研究检测了驱动G1/S期转换的关键细胞周期蛋白（Cyclin）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的表达。Western Blot和qRT-PCR结果（论文中图3）一致显示：三个铜处理组的p-CDK2（活化的CDK2）和Cyclin E/D蛋白水平在21天和42天均显著下降；CDK4蛋白水平在42天时于8和16 mg/kg组显著下降。相应的，这些基因的mRNA表达也呈现下调趋势。由于Cyclin D/CDK4/6和Cyclin E/CDK2复合物的活性是推动细胞通过G1期限制点进入S期的关键，它们的表达抑制直接解释了观察到的G0/G1期停滞。
4. Ras/PI3K/Akt信号通路被抑制 接下来，研究深入分析了上游调控通路。结果显示（论文中图4），铜暴露抑制了经典的促增殖Ras/PI3K/Akt通路：三个处理组的Ras蛋白表达均显著下调；p-PI3K (Tyr458)和p-Akt (Thr308)的蛋白水平（代表通路活化状态）在8和16 mg/kg组显著降低；同时，作为该通路关键负调控因子的PTEN，其蛋白和mRNA表达均显著上调。此外，p-PTEN（失活形式）的蛋白水平在8和16 mg/kg组下降。这些数据共同表明，铜暴露通过上调PTEN表达，抑制了Ras/PI3K/Akt信号通路的活化。
5. Akt下游效应分子FoxO3a和GSK-3β的活化改变 活化的Akt通过磷酸化其下游靶点如FoxO3a和GSK-3β来抑制它们的活性，从而促进细胞周期进程。本研究结果（论文中图5）显示，铜处理组的p-FoxO3a (Ser253)和p-GSK-3β (Ser9)蛋白水平显著降低，而FoxO3a和GSK-3β的mRNA水平升高。这意味着被抑制的Akt无法有效磷酸化（即抑制）FoxO3a和GSK-3β，导致二者活性相对增强。
6. 周期抑制蛋白p21和p27表达上调 活化的FoxO3a可以转录激活p21和p27等周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CKIs）。GSK-3β则可通过促进Cyclin D的磷酸化和降解来负调控其稳定性。与这一机制相符，研究结果（论文中图5，6）发现，铜暴露后，p27和p21的蛋白及mRNA表达水平均显著升高。p21的上调还与p53通路的激活有关：铜暴露增加了p-p53 (Ser15)蛋白和p53 mRNA的表达，同时降低了p53的负调控因子MDM2的表达（论文中图6）。p21和p27水平的升高，进一步抑制了CDK2/4的活性。
结论与意义 本研究系统性地得出结论：过量铜暴露通过上调PTEN的表达，抑制了肝脏中的Ras/PI3K/Akt信号通路。被抑制的Akt无法充分磷酸化其下游靶点FoxO3a和GSK-3β，导致二者活性相对增强。活化的FoxO3a促进p21和p27等周期抑制蛋白的表达；活化的GSK-3β则促进Cyclin D的降解。同时，p53通路的激活也促进了p21的表达。这些变化共同导致驱动G1/S期转换的关键引擎分子Cyclin D/E和CDK4/2的表达与活性下降，最终引发肝细胞G0/G1期周期停滞（论文图式总结）。
这项研究的科学价值在于，它首次在小鼠模型中较为完整地阐明了铜诱导肝细胞G0/G1期停滞的分子信号轴：Cu → ↑PTEN → ↓Ras/PI3K/Akt → ↓p-FoxO3a/p-GSK-3β → ↑p21/p27 & ↓Cyclin D/E → ↓CDK4/2 activity → G0/G1 Arrest。这不仅深化了对铜肝脏毒理学机制的认识，将毒性效应与特定的细胞周期调控网络精确联系起来，也为理解其他金属或环境污染物干扰细胞增殖提供了可借鉴的研究思路和分子靶点。在应用价值上，该研究提示，针对Ras/PI3K/Akt通路或其上下游分子的干预，可能成为预防或缓解铜过量所致肝损伤的潜在策略。
研究亮点 1. 机制研究的系统性： 研究没有停留在表型观察，而是从细胞周期分布表型出发，逐层深入揭示了从上游信号通路（Ras/PI3K/Akt）到关键调控节点（FoxO3a， GSK-3β， p53），再到最终效应分子（Cyclin， CDK， CKI）的完整调控链条，逻辑严谨，证据链完整。 2. 时空动态观察： 实验设计了21天和42天两个时间点，并设置了4个剂量组，有效揭示了铜暴露效应的时间依赖性和剂量依赖性，使结论更具说服力。 3. 多维度验证： 综合运用了组织病理学、流式细胞术、Western Blot和qRT-PCR等多种技术，从组织形态、细胞表型、蛋白水平和mRNA水平等多个维度对同一科学问题进行了交叉验证，确保了数据的可靠性。 4. 明确的机制创新： 明确提出了铜通过上调PTEN来抑制Ras/PI3K/Akt通路这一核心机制，并详细验证了该通路下游如何通过FoxO3a和GSK-3β影响细胞周期进程，对已有研究（如Keswani等人2015年的发现）进行了重要的机制补充和深化。
其他有价值的信息 本研究的资助信息表明其得到了“长江学者和创新团队发展计划”及四川农业大学“双支计划”的支持，体现了该研究受到较高层面的学术认可和资源保障。此外，文中引用了大量相关文献，显示出研究者对该领域前沿的充分把握，并将自身工作置于更广阔的学术背景中进行讨论和定位。论文中提供的详细引物序列（表1）和抗体信息，也为其他研究者重复或拓展此项工作提供了便利。