南京师范大学的李鑫、施鹏伟、杜飞、张梓栩、李子佳等研究人员与盐城工学院的吴娜等合作者，在《Biotechnology Journal》期刊上于2024年发表了一项题为“创建转录与翻译双水平调控系统以增强重组蛋白生产”的研究。这项工作属于合成生物学和代谢工程领域，旨在解决构建细胞工厂（Cell Factory）过程中一个核心难题：如何精准平衡细胞生长与目标产物合成之间的资源竞争。当前，无论是通过可诱导启动子在转录水平调控，还是利用核糖体结合位点（Ribosome Binding Site, RBS）库在翻译水平调控，都存在动态调节能力有限、存在泄露表达（Leaky Expression，即在非诱导状态下不应有的基础表达）或成本较高等问题。近年来，基于遗传密码子扩展（Genetic Code Expansion, GCE）技术发展出的正交翻译系统（Orthogonal Translation System），为非天然氨基酸（Non-Canonical Amino Acid, ncAA）依赖的蛋白质表达调控提供了新工具，但其严谨性和调控动态范围仍有提升空间。因此，本研究的目标是优化现有的正交翻译调控系统，提升其调控的严谨性，并将其与转录水平调控工具结合，实现转录与翻译的双重严格调控，最终提升重组蛋白的生产效率。

本研究的工作流程包含以下几个关键步骤：

第一步，测试并优化正交翻译调控系统。 研究人员选择了一个基于詹氏甲烷球菌（Methanocaldococcus jannaschii）来源的正交氨酰-tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetase, aaRS）/tRNA对（位于pEvol质粒上），该系统可将对乙酰苯丙氨酸（p-acetylphenylalanine, pAcF）特异性地插入到蛋白质编码序列的琥珀密码子（TAG，即终止密码子UAG的DNA形式）位点。首先，他们在绿色荧光蛋白（GFP）基因的N端引入了一个琥珀密码子（构建为GFP+Tag），并在大肠杆菌C321.ΔA.exp宿主（该菌株基因组中所有321个天然琥珀密码子已被同义替换，且敲除了肽链释放因子1（Peptide Chain Release Factor 1, RF1））中进行测试。初步结果发现，即使不添加pAcF，仅添加阿拉伯糖（用于诱导pEvol质粒上aaRS的表达）也会导致显著的GFP泄露表达。为解决这一问题，他们将控制aaRS基因的阿拉伯糖诱导型启动子替换为组成型启动子Ptpi（新质粒命名为pEvol-Ptpi）。优化后，系统完全依赖pAcF进行诱导，泄露表达大幅降低，动态调控范围达到11.2倍。此外，研究还测试了不同浓度pAcF（0.01-20 mM）对表达水平和细胞生长的影响，发现表达水平与pAcF浓度正相关，但过高浓度（>10 mM）会抑制宿主生长。

第二步，探究正交翻译调控系统的普适性。 为验证该系统在不同遗传背景的大肠杆菌宿主中是否通用，研究团队设计了系列实验。首先，他们探究了基因组中内源性琥珀密码子和RF1蛋白的影响。利用CRISPR/Cas9技术，他们在C321.ΔA.exp菌株中恢复了RF1功能（得到C321菌株），并比较了该系统在C321.ΔA.exp、C321和野生型MG1655菌株中的表现。结果显示，虽然敲除RF1和替换基因组琥珀密码子（如C321.ΔA.exp）能略微提高目标蛋白的表达效率，但在保留RF1和天然琥珀密码子的菌株（如C321和MG1655）中，该系统依然能够以较低的泄露和可观的动态范围（例如在MG1655中为3.44倍）工作，说明该系统对宿主基因组的依赖性不强，具有较好的普适性。随后，他们在更常用的蛋白表达宿主BL21(DE3)及其RF1敲除变体中也验证了这一结论。最后，他们将该系统转化到DH5α、TOP10、BL21、BLR(DE3)等多种常用大肠杆菌菌株中，发现所有菌株中系统均能正常工作，展现出至少4倍、最高11.6倍的动态调控范围，且对宿主生长影响甚微。

第三步，实现转录与翻译的双水平调控。 为了实现对基因表达更严格、更灵活的控制，研究人员将优化后的正交翻译调控系统（翻译水平）与不同类型的可诱导启动子（转录水平）进行组合。他们测试了四类常用诱导型启动子：四环素诱导型启动子（Ptet）、阿拉伯糖诱导型启动子（Para）、鼠李糖诱导型启动子（Prha）和IPTG诱导型启动子（Ptac）。结果非常显著：与单独使用诱导型启动子或正交翻译系统相比，双水平调控策略能极大地降低非诱导状态下的泄露表达，泄露水平降至最大荧光强度的4%以下。其中，与Ptac启动子组合效果最佳，非诱导泄露比单独使用Ptac时降低了96.6%。更重要的是，这种组合不仅降低了背景噪音，还扩大了基因表达的动态范围。例如，仅用Ptet调控时动态范围为26.1倍，仅用正交翻译调控时为7.24倍，而两者结合后动态范围扩大到77.4倍。这表明双水平调控实现了“1+1>2”的协同效应。

第四步，将正交翻译调控系统与T7表达系统耦合用于重组蛋白生产。 T7系统是高效生产重组蛋白的常用工具，但其强大的T7 RNA聚合酶（T7 RNA Polymerase, T7 RNAP）常导致严重的泄露表达和细胞毒性。为解决此问题，并避免直接将琥珀密码子引入目标蛋白可能带来的结构和功能改变，研究团队提出了一个创新策略：利用正交翻译系统来控制T7 RNAP本身的表达。他们使用CRISPR/Cas9技术在BL21(DE3)菌株的基因组上，在T7 RNAP基因的N端引入了一个琥珀密码子，构建了BL21(DE3)::T7 RNAP+Tag菌株。初步测试发现，仅替换T7 RNAP基因并未完全解决问题。于是他们进一步优化，用组成型但强度较弱的Pglk启动子替换了控制T7 RNAP表达的强启动子LacUV5，构建了BL21(DE3)::Pglk+Tag菌株。在这个优化系统中，非诱导状态下GFP的泄露表达相比原始BL21(DE3)::Pglk菌株降低了82.7%。只有在同时添加IPTG（诱导T7启动子）和pAcF（诱导功能性T7 RNAP合成）时，目标蛋白才会被高水平表达。

第五步，应用验证：提高酒精脱氢酶（Alcohol Dehydrogenase, ADH）产量。 为证明该策略的实际生产价值，研究人员以生产ADH作为概念验证。在优化后的BL21(DE3)::Pglk+Tag菌株中，ADH在非诱导状态下的泄露活性比原始BL21(DE3)菌株降低了64.9%。更重要的是，在同时诱导（IPTG + pAcF）条件下，ADH的活性比在原始BL21(DE3)菌株中仅用IPTG诱导时提高了9.82倍。这充分证明了该耦合策略不仅能有效抑制泄露，还能显著提升目标蛋白的最终产量。

本研究获得的主要结果如下：1. 通过将正交翻译系统中aaRS的表达由诱导型启动子改为组成型启动子，成功消除了阿拉伯糖的干扰，建立了一个严格依赖ncAA、泄露低、动态范围可达11.2倍的翻译水平调控工具。2. 系统验证表明，该正交翻译调控系统在多种大肠杆菌宿主中均能有效工作，对宿主基因组中内源RF1和琥珀密码子的依赖性较小，展现出良好的普适性。3. 将该系统与各类可诱导启动子结合，实现了转录与翻译的双重门控，将基因泄露表达降至极低水平，并将最大动态调控范围提升至77.4倍，显著优于单一水平的调控。4. 创新性地将该系统与T7表达系统耦合，通过ncAA控制T7 RNAP的表达，成功将T7系统的泄露表达降低82.7%，并避免了ncAA直接掺入目标蛋白的风险。5. 应用该耦合策略生产ADH，产量提升了9.82倍，实证了其在提高重组蛋白生产效率方面的强大潜力。

本研究的结论是，成功开发并优化了一套基于遗传密码子扩展的正交翻译调控系统，并通过将其与转录水平调控相结合，实现了对目标基因表达在翻译和转录双水平的精准、严格调控。这套“双锁”策略极大地降低了泄露表达，扩展了动态范围，并能与T7等高效表达系统兼容，最终显著提高了重组蛋白的产量。其科学价值在于为合成生物学和代谢工程领域提供了一种新颖、通用且高效的动态调控工具，深化了对多层次基因表达调控的理解与应用。其应用价值则直接体现在为构建高效、稳定、可控的微生物细胞工厂，用于化学品、药物蛋白等生物制造提供了强有力的技术方案。

本研究的亮点突出体现在以下几个方面：首先，方法的创新性与实用性：创造性地将正交翻译系统与经典诱导型启动子进行组合，实现了“转录+翻译”的双重验证与控制，这种组合策略新颖且效果显著。其次，解决问题的针对性：直指细胞工厂构建中“生长与生产”平衡以及T7系统泄露严重两大痛点，提出的解决方案（优化正交系统、耦合T7系统）直接有效。第三，系统验证的全面性：不仅验证了系统的核心功能，还深入探究了其在不同遗传背景宿主中的普适性、ncAA浓度依赖性、对细胞生长的影响等，为后续广泛应用打下了坚实基础。第四，从原理到应用的完整闭环：研究从分子机制探索开始，逐步优化系统，最终成功应用于实际蛋白（ADH）的生产并获得大幅产量提升，完成了从基础工具开发到实际生产力验证的完整链条。最后，研究中对CRISPR/Cas9基因组编辑技术的熟练应用，也为精确构建工程菌株提供了技术保障。这些工作共同构成了一项扎实且具有重要影响力的合成生物学研究成果。