可调控筛分性能的支化聚合物-蛋白质生物偶联物的设计与研究

作者及机构
本研究的通讯作者为卡内基梅隆大学化学系的Krzysztof Matyjaszewski教授，合作者包括Kriti Kapil、Hironobu Murata、Grzegorz Szczepaniak以及Amgen Research的Alan J. Russell。研究成果发表于ACS Macro Letters期刊，2024年4月4日在线发表（DOI: 10.1021/acsmacrolett.4c00059）。

学术背景

蛋白质-聚合物偶联物（protein-polymer conjugates）结合了蛋白质的生物活性与合成聚合物的理化特性，在生物医学领域具有重要应用价值。传统方法（如PEG化）虽能降低免疫原性，但可能抑制细胞吸收或酶活性。近年来，“从表面接枝”（grafting-from）策略通过原子转移自由基聚合（ATRP）在蛋白质表面直接生长聚合物链，可提高接枝密度并保留蛋白质功能。然而，线性聚合物无法完全屏蔽蛋白质与其他生物大分子的非特异性相互作用。

本研究提出利用可控支化自由基聚合（CRBP, Controlled Radical Branching Polymerization）技术，以水溶性引发剂单体（inibramer）——2-溴丙烯酸钠（SBA）为核心，在绿色光诱导下合成支化聚合物-蛋白质偶联物。目标是通过调控支化密度，实现可调筛分性能（tunable sieving behavior），即选择性允许小分子底物接近蛋白质活性位点，同时阻挡大分子抑制剂。

研究流程与方法

1. 支化聚合物-蛋白质偶联物的合成

研究对象：以胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin, CT）为模型蛋白，因其结构明确且商业抑制剂丰富。
关键步骤：
- 蛋白引发剂制备：通过文献方法合成含12个溴引发位点的CT宏引发剂（CT-iBBr12）。
- 支化聚合反应：在绿色LED（525 nm）照射下，以SBA为支化单体，通过光氧化还原/铜双催化体系（Eosin Y/CuBr2/TPMA）在水相PBS缓冲液中实现氧耐受的CRBP。
- 支化密度调控：通过改变SBA与线性单体（如CBMA或OEOMA）的比例（2%-20%），获得不同支化程度的偶联物。

创新方法：
- inibramer化学：SBA在聚合过程中原位生成支化点，实现“一锅法”支化结构控制。
- 高通量合成：采用24孔LED阵列平行反应装置，确保光强、温度（15-18°C）和反应时间的均一性。

2. 结构与性质表征

• 分子量与结构分析：通过尺寸排阻色谱-多角度光散射联用（SEC-MALS）验证支化聚合物的可控接枝，显示单峰分布且分子量与理论值接近（Đ ≤ 1.65）。
  
• 构象分析：微波辅助酸水解分离聚合物链，通过动态光散射（DLS）和粘度测定证实支化聚合物的流体力学半径小于线性聚合物。
  

3. 酶活性与筛分效应评估

• 酶动力学实验：以小肽底物（Suc-AAPF-pNA）测定CT偶联物的米氏常数（Km）和转换数（kcat）。结果显示，支化PCBMA偶联物保留90%活性，且Km降低20%-30%（亲和力提升）。
  
• 抑制剂屏蔽实验：
  
  • Bowman-Birk抑制剂（BBI, 8 kDa）：支化偶联物（如CT-b-2%-PCBMA）在400 nM BBI存在下保留80%活性，而线性偶联物仅70%。抑制常数（Ki）分析显示支化结构使BBI的Ki提升17倍。
    
  • Aprotinin抑制剂（AP, 6.5 kDa）：支化结构对较小抑制剂的屏蔽效果减弱（Ki提升6-8倍），表明筛分效应与抑制剂尺寸相关。
    

主要结果与逻辑关联

1. 支化结构增强筛分效应：支化聚合物通过紧密堆积形成更有效的空间屏障，显著抑制大分子抑制剂（如BBI）的渗透，同时允许小分子底物接近活性位点。
   
2. 光氧化还原体系的局限性：绿色光照射和Eosin Y可能导致CT活性部分损失（约35%），但支化偶联物的活性仍优于线性对照。
   
3. 构效关系：支化密度需优化，过高（>10% SBA）会导致凝胶化，分子量测定偏差达40%。
   

研究结论与价值

科学价值：
- 首次将CRBP技术应用于蛋白质-支化聚合物偶联物的合成，提供了一种精准调控筛分性能的新策略。
- 揭示了支化密度与筛分效应的定量关系，为设计功能性生物偶联物奠定理论基础。

应用潜力：
- 治疗酶工程：如尿酸酶（痛风治疗）或天冬酰胺酶（白血病治疗）的修饰，可避免抗体识别和蛋白酶降解。
- 药物递送：支化聚合物的低粘度和弱纠缠特性有利于提高递送效率。

研究亮点

1. 方法创新：开发了水相、氧耐受的绿色光诱导CRBP技术，突破了传统支化聚合对苛刻条件的依赖。
   
2. 功能设计：通过inibramer实现支化密度的精准调控，首次证明支化结构对蛋白质抑制剂的筛分优势。
   
3. 跨学科融合：结合高分子化学（ATRP）、酶动力学和生物偶联技术，推动蛋白质-聚合物杂化材料的发展。
   

其他有价值内容

未来研究方向包括：
- 探索低能量光源（如红光或近红外）以减少光损伤；
- 测试更大分子量抑制剂（如α1-抗胰凝乳蛋白酶，54 kDa）的筛分效果；
- 评估支化偶联物的热稳定性与pH稳定性。

本研究为生物医学领域提供了兼具高活性和长效性的蛋白质修饰新范式。