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毛细管区带电泳结合在线电动力学样本净化技术用于8-氨基芘-1,3,6-三磺酸标记碳水化合物的分析
作者与机构
本研究由匈牙利帕农大学分子与化学工程研究所转化糖组学团队的Robert Farsang、Kinga Hogyor、Gabor Jarvas和通讯作者Andras Guttman*（同时任职于德布勒森大学霍瓦特·乔巴生物分离科学纪念实验室）合作完成，成果发表于《Analytical Chemistry》2023年第95卷（出版日期：2023年11月3日），页码16459–16464。
研究领域与动机
蛋白质糖基化分析在生物医学、生物制药及食品工业中至关重要。由于碳水化合物缺乏生色团或荧光团，传统毛细管电泳（Capillary Electrophoresis, CE）分析需通过带电荷荧光标记（如8-氨基芘-1,3,6-三磺酸，APTS）实现检测。然而，标记反应中过量试剂的干扰迫使样本需额外纯化步骤（如凝胶过滤、固相萃取），不仅增加成本，还可能导致分析物损失。本研究旨在开发一种在线电动力学样本净化方法，通过碱性pH缓冲液和正向电压模式，利用电渗流（Electroosmotic Flow, EOF）与电迁移的协同作用，实现无需纯化的高分辨率分离。
理论基础
传统低pH凝胶缓冲体系采用反向电压（阴极在检测端），依赖分析物的质荷比分离，但过量APTS的拖尾峰会掩盖低聚糖信号。而碱性条件下，EOF可逆转带负电荷分析物的迁移方向：当分析物的有效电泳迁移率（μeff）小于EOF迁移率（μeof）时，分析物被推向检测器；反之，高迁移率的游离APTS被排除在毛细管外。本研究通过150 mM己酸-253 mM Tris（pH 8.1）缓冲液（简称Catris）验证了这一理论。
1. 样本制备
- 对象与处理：
- 麦芽低聚糖标准品（DP1–25+）：作为模型碳水化合物，验证方法普适性。
- 人血清N-聚糖：通过PNGase F酶解从稀释10倍的人血清中释放，样本量40 μL。
- 标记反应：采用蒸发衍生化协议，APTS（20 mM）与样本在60°C反应1小时，反应体系含35%乙酸和40%四氢呋喃，以促进还原胺化反应。
2. 毛细管电泳系统
- 仪器：Beckman Coulter PA800 Plus，配备激光诱导荧光检测器（488 nm激发/520 nm发射）。
- 创新方法：
- 在线净化：30 μm内径裸熔融石英毛细管（30 cm有效长度），碱性Catris缓冲液，30 kV正向电压（阳极在进样端）。
- 传统对照：低pH凝胶缓冲体系，反向电压（阴极在进样端）。
- 关键参数：EOF迁移率（μeof=2.15×10⁻⁸ m²V⁻¹s⁻¹）通过缓冲液组成精确调控，以匹配分析物μeff。
3. 数据分析
通过表观迁移率（μapp=μeof+μeff）计算各组分迁移方向，验证APTS（μeff=−2.92×10⁻⁸ m²V⁻¹s⁻¹）因μapp为负值而被排除，而麦芽糖（DP2，μeff=−1.66×10⁻⁸ m²V⁻¹s⁻¹）因μapp>0被检测。
1. 麦芽低聚糖验证实验
- 分离效果：DP2–DP25+均被检出（图1），DP25峰清晰可见（插图），未纯化样本中APTS信号完全消失（下轨迹）。
- 理论验证：计算证实DP2的μapp=4.95×10⁻⁹ m²V⁻¹s⁻¹，与实验观测一致。
2. 人血清N-聚糖分析
- 与传统方法对比：
- 低pH凝胶缓冲：需纯化以消除APTS拖尾峰（图2a插图），分离时间较长。
- Catris缓冲液：直接进样未纯化样本（图2b），分离时间缩短35%，检出37个峰（与传统方法一致），但迁移顺序反转（表1）。
- 重现性：迁移时间与峰面积RSD分别为1.09%和1.66%。
3. 潜在偏差
纯化过程可能导致部分聚糖损失（如结构FA2BG2S2的峰面积变化），但本研究聚焦方法开发，未深入量化此效应。
科学意义
- 方法学创新：首次将EOF辅助的在线电动力学净化应用于CE糖分析，解决了传统纯化步骤的样本损失问题。
- 理论贡献：通过μapp模型明确了碱性条件下EOF与电迁移的协同机制，为复杂碳水化合物分析提供了新范式。
应用价值
- 流程简化：省略纯化步骤，适合高通量临床或工业场景（如生物制药质量控制）。
- 兼容性扩展：该方法可评估其他纯化技术（如HILIC）的效率，弥补色谱法无法逆转迁移顺序的局限。
（注：文中所有专业术语首次出现时均标注英文原名，如电渗流（Electroosmotic Flow, EOF）、毛细管电泳（Capillary Electrophoresis, CE）等。）