Fabricia P. Pimenta等作者来自巴西里约热内卢州立大学医学院（Universidade do Estado do Rio de Janeiro），于2008年在期刊*Molecular and Cellular Probes*（第22卷）发表了一项关于白喉杆菌（*Corynebacterium diphtheriae*）实验室诊断方法的研究。该研究首次提出以dtxr基因为靶点的物种特异性PCR技术，用于区分白喉杆菌与其他棒状杆菌样菌落，并验证了其在临床诊断中的可行性。

学术背景

白喉作为一种由产毒白喉杆菌引起的呼吸道传染病，其全球防控面临两大挑战：一是成人疫苗接种后免疫力下降导致的易感性增加；二是非产毒白喉杆菌（non-toxigenic strains）引发的系统性感染（如心内膜炎）病例增多。传统诊断依赖表型鉴定（如生化试验）和毒素检测，但存在耗时长、灵敏度低的问题。此前研究表明，所有白喉杆菌均携带dtxr基因（编码调控代谢和毒素表达的全局转录因子），而其他棒状杆菌虽存在同源基因，但序列差异显著。因此，研究团队旨在开发一种基于dtxr基因的快速、特异性PCR方法，以优化实验室诊断流程。

研究流程

1. 菌株样本与鉴定

   • 研究对象：91株白喉杆菌（54株非产毒，37株产毒；涵盖mitis、gravis、belfanti三种生物型）、1株*C. ulcerans*、3株*C. pseudotuberculosis*，以及111株非白喉革兰阳性杆菌（包括19种其他棒状杆菌属和*Rhodococcus*等）。
     
   • 对照菌株：ATCC和CDC提供的标准菌株（如ATCC 27012产毒株）。
     
   • 表型鉴定：通过传统生化试验（硝酸盐还原、尿素水解等）和API Coryne系统完成菌种确认。
     

2. 毒力检测

   • Vero细胞毒性试验：检测白喉毒素活性。
     
   • tox基因PCR（PCR-dt）：使用引物组dt扩增毒素基因片段A，验证产毒能力。
     

3. dtxr基因PCR开发

   • 引物设计：基于已发表的dtxr基因序列，设计4组引物（dtxr1-dtxr4），覆盖基因全长。
     
   • DNA提取：煮沸法裂解细菌，离心取上清作为模板。
     
   • PCR条件：35个循环（94℃ 60秒→55℃ 60秒→72℃ 90秒），最终延伸72℃ 10分钟。
     
   • 特异性验证：优先选择dtxr1引物组（258 bp产物）测试非白喉菌株。
     

4. 数据分析

   • 通过凝胶电泳确认扩增片段大小，与预期产物比对。
     
   • 统计PCR阳性率，并与表型鉴定结果交叉验证。
     

主要结果

1. dtxr-PCR的特异性与灵敏度

   • 所有91株白喉杆菌（包括不同生物型、毒力状态和分离部位）均成功扩增出预期片段（图1），与表型鉴定结果100%一致。
     
   • 非白喉菌株（如*C. ulcerans*和*C. pseudotuberculosis*）及111株其他革兰阳性杆菌均为阴性，表明dtxr1引物组具有高度物种特异性。
     

2. 技术优势

   • 快速性：从DNA提取到结果判读可在4小时内完成，远快于传统生化方法（需24-48小时）。
     
   • 成本效益：无需测序或杂交等后续步骤，适合临床实验室常规筛查。
     

3. 与毒力基因的关联

   • 55株非产毒菌株均携带dtxr基因，证实该基因与毒素表达无关，而是白喉杆菌的核心遗传标记。
     

结论与价值

本研究首次将dtxr基因PCR技术应用于白喉杆菌的临床鉴定，其核心价值在于：
1. 科学意义：明确了dtxr基因作为白喉杆菌物种特异性标志物的可靠性，为后续分子流行病学研究提供基础。
2. 应用价值：为公共卫生实验室提供了一种高效、低成本的筛查工具，尤其适用于非典型病例（如无假膜形成的感染）和携带者监测。
3. 技术革新：通过优化引物设计和反应条件，实现了无需测序的直接鉴定，简化了操作流程。

研究亮点

• 创新性方法：首次开发以dtxr基因为靶点的单步PCR鉴定方案，突破传统依赖多步骤分析的局限。
  
• 全面验证：覆盖白喉杆菌所有生物型及临床常见干扰菌株，数据支撑充分。
  
• 临床适配性：方法易于标准化，可整合至现有实验室诊断体系，提升监测效率。
  

其他发现

研究指出，尽管部分非白喉棒状杆菌（如*C. glucuronolyticum*）的dtxr基因序列与白喉杆菌有同源性，但在严格PCR条件下未出现交叉反应，进一步验证了引物设计的特异性。此外，作者建议在推广中需同步使用阳性和阴性对照，以确保结果准确性。

该成果为白喉的全球防控提供了关键技术支撑，尤其在资源有限地区具有显著推广潜力。