本文的主要作者为 Ying-Chun Yu、Yoshiro Sohma、Shinichi Takimoto、Takayuki Miyauchi 和 Masato Yasui，作者分别隶属于 Keio University School of Medicine、Olympus Corporation 等机构。该研究成果发表于 *Scientific Reports*，发表时间为 2013 年 9 月 25 日，文章题目为“Direct visualization and quantitative analysis of water diffusion in complex biological tissues using CARS microscopy”。
本研究属于膜生物物理学和光学成像领域，探讨了水分在复杂生物组织中扩散的机制及其测量方法。水分扩散在维持生命过程中具有重要意义，因为水分不仅是细胞内外的溶剂，还负责将营养物质和信号分子分布到组织的细胞间隙。然而，目前尚无技术手段可以在显微水平精确测量水分在复杂组织中扩散的细节。
近几十年，非线性光学显微技术（如相干反斯托克斯拉曼散射显微术，CARS microscopy）的发展为研究生物分子结构和动态过程开辟了新路径。以前的研究表明，这种技术能够通过检测O-H键的振动成像水分扩散，但多数研究仅限于简单的细胞体系，尚未在复杂生物组织中得到应用。此外，自水通道蛋白（Aquaporin, AQP）发现以来，其在水稳态中的重要角色受到广泛关注，然而针对组织内水扩散具体通路及其响应机制的研究仍存在技术瓶颈。
本研究旨在开发一种新型方法，能够直接在三维复杂组织中观察并量化水分扩散动态，进而探讨水通道蛋白和激素刺激对水扩散通透性的影响。
研究整体可以分为以下几个关键环节：
研究团队与 Olympus 公司合作开发了一种定制化的逆向 CARS 显微镜平台。实验中，利用 H2O 和 D2O 的交换过程，通过 CARS 信号的振动对比分析水分扩散。研究采用计算模型分析 CARS 的 O-H 键振动数据，对 H2O 浓度与信号强度之间的关系进行校准，并制作标准曲线以量化数据。
实验选用犬肾小管上皮细胞（Madin-Darby Canine Kidney, MDCK）和小鼠皮质集合管细胞（Cortical Collecting Duct, CCD, M-1）在 Matrigel 中生长形成的 3D 囊泡（Cysts）作为研究模型。这些囊泡具有统一厚度的上皮层，具备实验所需的球状结构。
通过免疫组化实验验证囊泡的细胞核、细胞膜形态以及紧密连接（Tight Junction）的完整性，确认实验样本的可靠性。
研究通过逐步将培养基从 H2O 转换为 D2O 溶液并持续记录 CARS 光学信号，捕获水分子扩散动态。信号强度的变化代表 H2O 浓度的降低，研究团队设计了一个计算机仿真模型来评估 luminal 和 basolateral 膜的扩散水通透性。
光学数据通过一种多层三腔室模型进行拟合分析，采用 MATLAB 编码的程序对数据进行归一化处理，进一步估算水通透性数据，并区分跨膜和旁路通透性。
成功实现水分扩散的直接可视化： 通过 CARS 显微镜清晰观测到了 H2O 向 D2O 交换的过程，包括细胞间与囊泡腔膜的信号强度变化。
膜水通透性的定量化测定： 在 MDCK 囊泡模型中，基底侧膜的水通透性显著高于顶侧膜（2.4 ± 0.4 × 10^-3 cm/s 对 1.2 ± 0.2 × 10^-3 cm/s），而紧密连接通透性可以忽略不计。
AQP4 的功能验证： 稳定转染 AQP4 的 MDCK 囊泡，其基底侧水通透性提高了 3 至 4 倍，而顶侧膜水通透性未见显著变化，体现了 AQP4 的区域化分布。
激素刺激对水通透性的显著调控： M-1 囊泡在使用血管加压素后，AQP2 的转运和定量分析显示，顶侧膜水通透性提高了约 50%。基底侧膜未受影响，这与 AQP4 的作用一致。
通过开发适用于复杂生物组织的 CARS 显微方法，本研究首次实现了水分扩散的显微级别动态观测与定量化分析。研究揭示了生理条件下水分跨细胞膜的运动模式和关键调节机制，并首次分离测定了顶侧膜和基底侧膜的水通透性，为深入理解水通道蛋白功能及其在病理条件下的调控机制提供了新工具。
该研究具有重要的科学价值，首次以无标签的方式观察水扩散动力学，为细胞生物学、膜生物物理学和医学研究开辟了新途径。同时，其成果也为探索基于水动态调控的诊疗技术（如脑水肿、肾功能疾病治疗）提供了可能性。
研究为更广泛的生物医学领域提供了全新的研究思路，特别是在器官微循环、脑功能调节等复杂组织研究中具有延展潜力。