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关于人类造血干细胞中层粘连蛋白受体BCAM/Lu和整合素α7β1的研究报告
一、 研究团队与发表信息
本研究由德国蒂宾根大学医院的 Parimala Sonika Godavarthy、Christina B. Walter、Claudia Lengerke 和 Gerd Klein（通讯作者）共同完成。研究论文于2021年10月22日发表在期刊 Frontiers in Cell and Developmental Biology 上，文章标题为“The laminin receptors basal cell adhesion molecule/Lutheran and integrin α7β1 on human hematopoietic stem cells”。该研究隶属于“细胞粘附与迁移”专业领域。
二、 学术背景与研究目的
在成年生物体内，造血干细胞和祖细胞（Hematopoietic Stem and Progenitor Cells, HSPC）定居于骨髓（Bone Marrow, BM）中被称为造血干细胞生态位的特殊微环境里。细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）是这个生态位不可或缺的组成部分。层粘连蛋白（Laminins, LMs）是一类异源三聚体的ECM分子，其中主要包含α4或α5链的家族成员在骨髓生态位细胞中表达，并参与HSPC的归巢和增殖过程。此前的研究已经鉴定并表征了多种整合素和非整合素类层粘连蛋白受体，例如整合素α6β1和α3β1被报道在人和小鼠HSPC上强表达。
然而，对于另外两种特定的层粘连蛋白受体——整合素α7β1和基底细胞粘附分子/路德抗原（Basal Cell Adhesion Molecule/Lutheran, BCAM/Lu）——在人类HSPC上的表达和功能，尚缺乏深入的研究。特别是BCAM/Lu，此前仅被认为在红细胞谱系发育晚期表达，而未在早期的HSPC中发现。鉴于层粘连蛋白几乎是所有干细胞生态位的核心成分，明确其受体在HSPC上的完整谱系及功能至关重要。
因此，本研究旨在深入探究BCAM/Lu和整合素α7β1这两种层粘连蛋白受体在人类HSPC上的表达情况，并初步阐明它们的功能，特别是BCAM/Lu在HSPC粘附、增殖、迁移和分化过程中的作用。
三、 详细研究流程与方法
本研究采用了多种分子生物学、细胞生物学和功能实验技术，系统性地验证了两种受体在人类HSPC上的表达并探索了其功能。
1. 研究样本与细胞系： * 主要研究对象： 人脐带血来源的CD34阳性HSPC。通过密度梯度离心获得脐带血单个核细胞（Cord Blood Mononuclear Cells, CBMNC），再使用CD34微珠进行阳性磁珠分选富集。为获得更纯净的HSPC群体，部分实验使用了谱系阴性（Lineage-negative, Lin-）的细胞，通过使用针对多种谱系标志物（如CD2, CD3, CD11b等）的抗体混合物进行阴性分选获得。 * 生态位对照细胞： 包括人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC）、骨髓来源的间充质基质细胞（Mesenchymal Stromal Cells, MSC）以及原代成骨细胞（Primary Osteoblasts, POB）。这些细胞用于模拟HSPC所处的骨髓微环境，并作为BCAM/Lu表达的阳性对照。 * 对照细胞系： 使用K562（红白血病细胞系）、KG1a（早幼粒细胞系）和THP1（单核细胞系）作为阴性或阳性对照。 * 样本量： 功能实验（如迁移、集落形成）通常使用来自至少三位不同供体的CD34+ HSPC进行，以确保结果的可靠性和普适性。
2. 实验流程与分析方法： 研究流程可分为表达验证和功能探究两大部分。
第一部分：受体表达验证 * RT-PCR与定量RT-PCR (qRT-PCR)： 从CD34+ HSPC、MSC、POB和HUVEC中提取总RNA并逆转录为cDNA。使用特异性引物扩增BCAM/Lu和整合素α7的mRNA。对于整合素α7，还设计了特异性引物来区分其不同的剪接变异体（X1, X2, X1X2）。qRT-PCR用于量化BCAM/Lu在不同细胞类型中的转录水平相对差异。 * 蛋白质免疫印迹（Western Blot）： 制备上述各种细胞的裂解物，通过SDS-PAGE分离蛋白并转膜。使用针对BCAM/Lu胞外域或整合素α7链的特异性单克隆抗体进行检测，以在蛋白质水平确认表达。 * 免疫荧光染色： 将Lin- CBMNC通过细胞离心涂片，或将HUVEC、MSC、POB培养在腔室玻片上。固定后，使用抗BCAM/Lu、抗CD34或抗整合素α7的一抗，以及相应的荧光二抗进行染色，细胞核用DAPI复染。通过荧光显微镜观察蛋白的共定位和表达模式。 * 流式细胞术（Flow Cytometry, FACS）： 对Lin- CD34+ HSPC、骨髓细胞或生态位细胞进行表面染色。使用APC标记的抗BCAM/Lu抗体和FITC标记的抗CD34抗体进行双标，或使用未标记的抗整合素α7一抗加荧光二抗。通过流式细胞仪定量分析表达这些受体的细胞比例和表达强度。
第二部分：BCAM/Lu功能探究 * 细胞-基质粘附实验： 将重组层粘连蛋白亚型（如LM-411, LM-511, LM-521）点在培养皿上干燥包被。将CD34+ HSPC接种到包被好的区域，在含有或不含有功能阻断性抗BCAM/Lu抗体或重组BCAM/Lu蛋白的条件下孵育。清洗后，在显微镜下观察并评估细胞特异性粘附到不同层粘连蛋白上的能力。 * 细胞增殖实验： 在无血清扩增培养基中培养CD34+ HSPC，并添加可溶性的不同层粘连蛋白亚型（LM-211, LM-511, LM-521等）。在培养的第1、2、3天进行细胞计数。此外，还使用了CFSE染料稀释法来追踪细胞分裂。同时，在含有LM-511/521的培养基中加入抗BCAM/Lu抗体，以检测该受体是否介导了层粘连蛋白对增殖的影响。 * 跨内皮迁移实验（Transmigration Assay）： 在Transwell小室的上室培养HUVEC形成单层内皮屏障。将CD34+ HSPC预经抗BCAM/Lu抗体或对照抗体处理后，加入上室。下室培养基中添加或不添加趋化因子SDF-1α。孵育16小时后，收集迁移到下室的细胞，通过测定DNA含量（CyQuant法）来量化迁移细胞数，以此评估BCAM/Lu在HSPC穿越内皮层过程中的作用。 * 集落形成单位实验（Colony Forming Unit Assay）： 将CD34+ HSPC用抗BCAM/Lu抗体预处理3天后，接种到甲基纤维素半固体培养基中。培养14天后，根据形态学计数不同类型的造血集落，包括红细胞爆式集落形成单位（BFU-E）、粒细胞-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）和混合集落形成单位（CFU-GEMM），以评估BCAM/Lu对HSPC分化为不同谱系潜能的影响。
3. 数据分析方法： 所有数值以平均值±标准差表示。使用GraphPad Prism软件进行统计学分析，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）或t检验。显著性水平设定为*p < 0.05， **p < 0.005， ***p < 0.0005， ****p < 0.001。
四、 主要研究结果
1. BCAM/Lu和整合素α7β1在人类HSPC上显著表达： * RT-PCR和qRT-PCR结果显示，BCAM/Lu的mRNA在CD34+ HSPC、MSC、POB和HUVEC中均有表达，但在HUVEC中的表达量比HSPC高约10倍。 * 蛋白质免疫印迹证实了BCAM/Lu蛋白在HSPC上的表达，其信号强度弱于HUVEC，但明确存在。阴性对照细胞系K562和KG1a无表达。 * 免疫荧光和流式细胞术进一步验证：约45%的骨髓CD34+细胞以及绝大多数脐带血Lin- CD34+细胞表达BCAM/Lu。同时，HUVEC和MSC上BCAM/Lu表达很强，POB上表达较弱。 * 对于整合素α7，RT-PCR证实CD34+ HSPC表达其mRNA，且特异性引物扩增表明只表达X1剪接变异体，不表达X2或X1X2型。 * 免疫荧光显示，所有Lin- CD34+ HSPC均共表达整合素α7。流式细胞术和蛋白质免疫印迹（检测到117 kDa特异条带）也证实了整合素α7蛋白在HSPC上的高表达。
2. BCAM/Lu的功能特性： * 粘附作用： CD34+ HSPC能强烈粘附于含有α5链的层粘连蛋白（LM-511和LM-521），但不粘附于含有α4链的LM-411。然而，使用功能阻断性的抗BCAM/Lu抗体并不能抑制HSPC对LM-511/521的粘附。相反，当在粘附体系中加入可溶性的重组BCAM/Lu蛋白时，则能显著阻断HSPC与LM-511/521的结合。这表明，虽然BCAM/Lu参与识别层粘连蛋白，但在粘附过程中可能并非唯一或主导的受体，其他受体（如整合素）可能补偿了其功能；而外源重组蛋白则通过竞争性结合层粘连蛋白，阻断了所有受体的作用。 * 增殖影响： 可溶性的LM-511和LM-521能显著且剂量依赖性地抑制CD34+ HSPC的增殖，而LM-211无此效应。但抗BCAM/Lu抗体不能逆转LM-511/521对增殖的抑制作用，说明这种增殖抑制效应并非由BCAM/Lu直接介导。 * 迁移作用： 在跨内皮迁移实验中，趋化因子SDF-1α能有效促进CD34+ HSPC穿越HUVEC单层。预先用抗BCAM/Lu抗体处理HSPC，能显著抑制这种SDF-1α诱导的跨内皮迁移，而对照抗体无效。这一结果强烈提示BCAM/Lu直接参与了HSPC的迁移过程。 * 分化作用： 在集落形成实验中，用抗BCAM/Lu抗体预处理CD34+ HSPC，导致形成的总髓系集落数显著减少，其中红系爆式集落（BFU-E）的减少尤为明显。这表明BCAM/Lu参与调控HSPC向红系/髓系分化的过程。
五、 研究结论与意义
本研究首次系统性地证实，两种此前未在人类早期HSPC中被充分研究的层粘连蛋白受体——BCAM/Lu和整合素α7β1（X1型）——在人类Lin- CD34+ HSPC上均有显著表达。
科学价值与结论： 1. 拓展了HSPC受体谱： 将BCAM/Lu的表达从传统认为的晚期红系细胞提前至最原始的造血干祖细胞阶段，更新了对于该分子在造血系统中表达模式的认识。 2. 揭示了BCAM/Lu的多元功能： 研究发现BCAM/Lu虽不介导HSPC对层粘连蛋白的主要静态粘附，也不直接参与层粘连蛋白诱导的增殖抑制，但在HSPC的跨内皮迁移和谱系分化（特别是红系分化）过程中扮演着重要角色。这暗示BCAM/Lu可能在HSPC离开生态位进入循环，或在不同生态位间迁移时发挥作用，并可能通过传递信号影响细胞命运决定。 3. 明确了整合素α7β1的表达特征： 确定了人类HSPC主要表达整合素α7的X1剪接体，这与其配体LM-511/521的偏好性相符，提示其可能作为HSPC的一个新的潜在标志物。 4. 强调了受体协同作用： 研究结果表明，在复杂的骨髓微环境中，HSPC通过表达包括整合素（α6β1, α3β1, α7β1）和非整合素（BCAM/Lu, 肌营养不良蛋白聚糖）在内的多种层粘连蛋白受体，形成了一个多样化的“受体工具箱”，以灵活应对不同层粘连蛋白信号，调控其驻留、迁移、增殖和分化。
应用价值与展望： * 基础研究层面： 该研究为深入理解造血干细胞生态位中细胞-基质相互作用的分子机制提供了新的线索。BCAM/Lu在迁移和分化中的功能，使其成为研究HSPC动员、归巢以及谱系定向分化的一个新靶点。 * 疾病研究层面： 研究提到整合素α7在急性髓系白血病细胞上的异常表达和功能，提示这些层粘连蛋白受体可能与血液系统恶性肿瘤的发生发展有关。未来研究可以探索BCAM/Lu和整合素α7在白血病干细胞生态位维持或耐药中的作用。 * 再生医学与治疗层面： 对HSPC表面受体更深入的理解，有助于优化体外扩增和培养体系（例如，通过调控层粘连蛋白涂层），也可能为开发促进造血干细胞移植效率或靶向白血病干细胞的策略提供新思路。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究在讨论部分提出了几个富有洞察力的推测和未来方向： 1. 推测BCAM/Lu可能同时表达于HSPC和内皮细胞上，两者之间的相互作用可能共同促进了HSPC的跨内皮迁移。这为后续细胞间相互作用研究指明了方向。 2. 提出LM-511/521可能以“可溶性形式”抑制增殖，而以“基质网络形式”支持分化，这种相反效应取决于其呈现方式，这是一个有待验证的有趣假设。 3. 强调了未来研究需要进一步揭示这些不同的层粘连蛋白受体如何协同工作，共同调控HSPC的粘附、自我更新、迁移和增殖，并探索这些机制在血液系统恶性肿瘤发病中的意义。
这项研究是一项系统而深入的原创性工作，它丰富了我们对于造血干细胞与骨髓微环境相互作用分子机制的理解，并为相关的基础与转化研究开辟了新的途径。