作者：Fei Zhang、Yuxin Peng、Dongdong Fan、Guoxu Song、Xing Gao、Yong Tian。研究单位：中国科学院生物物理研究所、中国科学院大学。发表于 *Nature Communications*，2025年，文章编号16:10693。

研究背景

CRISPR-Cas系统作为原核生物的适应性免疫系统，已被广泛开发为真核生物基因组操作工具。目前应用最广泛的Cas9和Cas12a蛋白通常大于1000个氨基酸，这使其难以通过FDA批准的腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体进行体内递送，因为AAV的装载上限仅为4.7 kb。因此，开发紧凑型RNA引导核酸酶（compact RNA-guided nucleases，RGNs）成为基因编辑领域的重要方向。

IscB（insertion sequences Cas9-like ORF B）被认为是Cas9的祖先蛋白，大小仅约400个氨基酸，且同时具有RuvC和HNH两个核酸酶结构域，因此比仅含RuvC结构域的Cas12类微型蛋白更适合转化为切口酶（nickase）以构建碱基编辑器（base editors，BEs）。OgeuIscB是首个在人类细胞中具有功能的IscB蛋白，但其识别基序（target-adjacent motif，TAM）NWRRNA较为复杂，且蛋白大小为496个残基。本研究聚焦于从特拉华湾水生样本宏基因组中鉴定出的CRISPR相关IscB系统——DelIscB，其TAM为更灵活的NAC，蛋白仅457个残基。研究目的是通过系统工程化DelIscB的蛋白和sgRNA，开发出高效的小型基因组编辑工具，并验证其在人类细胞和小鼠胚胎中的应用潜力。

研究流程与方法

本研究首先在大肠杆菌中建立质粒干扰实验以评估IscB蛋白的切割活性。该实验使用两个相容质粒：一个表达Cas9或IscB蛋白，另一个表达sgRNA/ωRNA并提供靶向或非靶向序列。共转化后，若靶质粒被切割，大肠杆菌克隆无法在含两种抗生素的平板上生长。结果显示DelIscB能够利用16-nt引导序列高效切割质粒，效率与SpCas9相当。随后，研究团队对DelIscB的非编码RNA（ncRNA）进行截短和poly-T基序突变（U136’A），获得了适合在哺乳动物细胞中由U6启动子转录的sgRNA-v1。利用荧光报告系统在HEK293T细胞中检测时发现，野生型DelIscB-CNLS的质粒切割效率仅约5%，融合T5核酸外切酶（T5 exonuclease，T5E）后提升至15%。

在蛋白工程化阶段，研究者首先利用AlphaFold2预测DelIscB蛋白结构，并与OgeuIscB的冷冻电镜结构（PDB：7UTN）进行比对，将EnIscB（OgeuIscB的高活性工程版本）中的7个高活性突变位点映射到DelIscB。结果显示仅S97R突变使活性提高2倍，其余4个对应突变均降低活性。随后，研究团队采用多重序列比对（multiple sequence alignment，MSA）策略，选取10个与DelIscB亲缘关系较近的IscB同源蛋白进行比对，针对DeliscB中中性或带负电的残基（若同源蛋白对应位置为正电荷残基则突变为精氨酸）共构建122个单突变体，筛选出8个活性变化超过1.2倍的突变（C12R、Q192R、E317R、Q340R、A343R、A364R、V396R和S436R）。此外，针对DelIscB在同源比对中独特的残基，构建了66个突变体，获得5个有效突变（L90E、S100A、G104S、W117F和A142P）。经过三个报告序列的交叉验证，最终筛选出14个平均活性提升超过1.2倍的突变进行组合。最佳组合DelIscB-v10.1包含10个突变（S97K、V396K、E317R、C12R、Q340K、W117F、A142P、S100A、G104S、S436R），活性约为野生型的5倍。

在sgRNA工程化阶段，以DelIscB-v1为基础，通过截短茎环结构（茎1.3和茎2区域的截短分别获得sgRNA-v2和v2.1，茎6截短获得v2.2）、将弱碱基对A-U或G-U替换为G-C以增强稳定性（获得sgRNA-v3和v3.1）、以及在假结（pseudoknot）区域引入错配突变以增加灵活性（U205A突变获得sgRNA-v4）等策略，最终将v4/v2/v2.2组合为sgRNA-v5。将sgRNA-v5与DelIscB-v10.1联合使用，分别命名为EnDelIscB（不含T5E）和EnDelIscB-T5E（含T5E）。

在基因组编辑效率评估阶段，研究在HEK293T细胞中选择24个内源基因位点，通过扩增子测序检测插入缺失（indels）效率。结果显示EnDelIscB较初始版本平均活性提升约48.9倍。EnDelIscB-T5E的平均编辑效率为54.27±28.07%，与EnIscB-T5E的53.70±29.84%相当。利用Cas-OFFinder预测脱靶位点并进行检测，发现两个靶点（EMX1-sg4和CXCR4-sg2）的16个预测脱靶位点几乎无indels，但VEGFA-sg2靶点有4个显著脱靶事件。进一步通过GUIDE-seq进行全基因组脱靶分析，在4个内源位点的检测结果表明EnDelIscB-T5E的脱靶reads比例高于EnDelIscB，提示T5E融合在提高靶上活性的同时也提高了脱靶活性。

在碱基编辑器开发阶段，研究者通过全长序列比对鉴定出DelIscB中对应OgeuIscB的RuvC和HNH活性残基（D60、E171、H226、H324和D327），并构建了D60A切口酶。将胞嘧啶脱氨酶hAPOBEC3A（高保真版本ha3a*）融合至EnDelIscB-D60A的C端并加上2×UGI，构建了胞嘧啶碱基编辑器iCBE。将腺苷脱氨酶TadA8e（高保真版本TadA*）二聚体融合至C端，构建了腺嘌呤碱基编辑器iABE。在多个内源位点的比较显示，iCBE的编辑窗口约为位置-1至12，iABE的编辑窗口约为位置-4至12。iCBE的最高碱基编辑效率为49.26±23.22%，iABE为60.22±22.47%，与基于EnIscB-D61A的miCBE和miABE相比无显著差异，且所有编辑器均诱导低频率的indels。

最后，研究在小鼠胚胎中验证了EnDelIscB系统的体内应用潜力。以酪氨酸酶（tyrosinase，Tyr）基因为靶标，在N2A细胞中筛选18条sgRNA，其中9条具有可检测活性，tyr-sg12效率最高。将EnDelIscB或EnDelIscB-T5E的mRNA与tyr-sg12共同显微注射入C57BL/6J小鼠受精卵后，EnDelIscB组39只F0小鼠中35只为全白毛色，2只为黑白混合，1只黑毛，1只早死；平均indel水平为96.77%。EnDelIscB-T5E组47只F0小鼠中44只全白，3只黑白混合；平均indel水平为98.67%。基因型与表型一一对应，成功高效构建了白化小鼠模型。

研究结论与意义

本研究通过对CRISPR相关IscB系统DelIscB的系统性表征与工程化改造，成功开发出高效的紧凑型基因组编辑器EnDelIscB和EnDelIscB-T5E，以及基于EnDelIscB切口酶的微型碱基编辑器iCBE和iABE。在小鼠胚胎中的高效基因编辑验证了其体内应用的巨大潜力。DelIscB的sgRNA包含repeat和anti-repeat区域，结构类似于Cas9系统的crRNA和tracrRNA，提示DelIscB可能代表了从祖先IscB系统向CRISPR-Cas9系统进化过程中的中间状态。本研究的蛋白工程策略（基于MSA引入同源蛋白中的天然有利突变）为RGNs的理性工程化提供了可操作的方法学参考。此外，通过AlphaFold3预测的结构分析，研究还提出了N端融合NLS或ha3a*导致活性降低的机制——空间位阻干扰了PLMP结构域与sgRNA 3’茎环的相互作用，从而影响RNP复合物的稳定性。

研究亮点

本研究的亮点在于：（1）首次系统表征并工程化了识别灵活TAM（NAC）的CRISPR相关IscB系统DelIscB，将其从几乎无活性的状态提升至与EnIscB-T5E相当的效率；（2）采用MSA引导的蛋白工程策略，相较于无偏的精氨酸扫描置换策略更为理性高效，为同类RGNs的工程化提供了新思路；（3）开发了基于EnDelIscB切口酶的高效微型碱基编辑器iCBE和iABE，丰富了紧凑型碱基编辑工具箱；（4）利用AlphaFold3结构预测对有利突变和融合策略的机制进行了解释，将计算结构生物学与实验工程化有机结合；（5）在小鼠胚胎中以接近100%的效率构建了白化模型，展示了EnDelIscB系统在体内基因编辑和疾病模型构建中的实用价值。