本文作者包括Yusuke Hagiwara、Yasuhiro Mihara（Ajinomoto Co., Inc. 生物科学产品与精细化学品研究所）、Tomoharu Motoyama、Sohei Ito、Shogo Nakano（静冈县立大学综合药学与营养科学研究生院及日本科学技术振兴机构PRESTO）。该研究发表于 *Applied and Environmental Microbiology*，2024年12月，第90卷第12期。研究属于蛋白质工程与生物技术领域，旨在克服哺乳动物碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）在大肠杆菌中难以活性表达及热稳定性低的问题。
碱性磷酸酶（AP）是二聚体、含锌的非特异性磷酸单酯酶，广泛存在于从原核生物到高等真核生物的各种生物体中。AP作为报告酶在酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等诊断领域中有重要应用，也用于分子生物学中DNA 5′末端磷酸基团的去磷酸化。然而，哺乳动物AP虽然比大肠杆菌AP（ECAP）活性高一至两个数量级，但在大肠杆菌中表达时容易错误折叠，且热稳定性较低。牛肠碱性磷酸酶同工酶II（bovine intestinal AP isozyme II，bIAPII）具有较高比活性，但其在大肠杆菌中的活性表达和热稳定性均不理想。研究采用序列基础的蛋白质再设计方法——完全一致性设计（full consensus design，FCD）和祖先序列重建（ancestral sequence reconstruction，ASR），构建了四种人工AP（FCAP_1、FCAP_2、AncAP_1和AncAP_2），以期提高大肠杆菌活性表达水平及热稳定性。
研究流程首先从bIAPII序列出发，通过BLASTP获取约5000条同源序列，经过去除长度偏差超过10%的序列、去除与库中其他序列一致性高于90%的序列，得到1161条序列。随后基于八个关键残基进行聚类筛选，获得25条序列的聚类库1（curated library_1）。经过多序列比对（multiple sequence alignment，MSA）并手动删除含缺口（gap）的序列，最终得到10条序列的聚类库2（curated library_2）。利用MAFFT对序列进行MSA，基于一致性残基将bIAPII的全部残基突变为最频繁残基，得到FCAP。利用MEGA构建最大似然系统发育树，并用FastML进行祖先序列推断，从系统发育树的两个不同节点选取得到AncAP_1和AncAP_2。四种人工AP与bIAPII的序列一致性为86%–91%，活性位点Ser92和锌结合位点Asp42、Ser92完全保守。
表达实验使用合成基因并优化大肠杆菌密码子，将基因亚克隆至pET28a(+)载体，转化至大肠杆菌Origami 2(DE3)菌株。培养条件为LB培养基过夜培养后转入主培养基，OD660达到0.5–0.7时加入IPTG至1 mM，在18°C培养24小时。通过SDS-PAGE分析可溶与不可溶部分，并使用对硝基苯磷酸（pNPP）为底物测定AP活性。纯化过程包括离子交换色谱（Hitrap Q HP）、疏水作用色谱（Hitrap Butyl HP）以及尺寸排阻色谱（Superdex 200 Increase 10⁄300 GL），AncAP的纯化则省去疏水作用色谱步骤。动力学参数通过改变pNPP浓度并拟合Michaelis-Menten方程获得。热稳定性测定为将酶在55°C–85°C孵育10分钟后测定残余活性，以55°C活性为100%计算T50。复性效率测定为将酶用6 M盐酸胍变性1小时，稀释50倍后在4°C复性69小时，计算复性后活性与变性前活性之比。单点突变分析构建了28个bIAPII突变体，这些突变位点在所有人工AP中共同改变但不同于bIAPII，分别测定其在60°C孵育10分钟后的残余活性和可溶表达水平。
主要结果显示，四种人工AP在可溶部分中的条带强度为bIAPII的0.69至2.4倍，但培养液活性均比bIAPII高一个数量级以上。AncAP_2的复性效率超过80%，比bIAPII高两个数量级。动力学分析表明，人工AP的kcat为bIAPII的65%–78%，但kcat/Km值中AncAP_2与bIAPII相当，其余三种人工AP提高超过2倍。热稳定性方面，T50从bIAPII的62.9°C提高至FCAP_1为76.3°C、FCAP_2为80.0°C、AncAP_1为77.4°C、AncAP_2为80.8°C，提高幅度为13°C–17°C，且未损失活性。AncAP_2在70°C和75°C孵育后活性达到最高水平，表明热诱导可促进部分错误折叠蛋白的正确折叠。单点突变实验中，T413E、G402S和E416D突变体在60°C孵育后残余活性超过50%，而bIAPII残余活性约为20%。可溶表达水平方面，I332V突变体活性约3000 U/L，为单点突变中最高，但仍远低于FCAP_2的19000 U/L。E343Q和E455Q突变体可溶表达也显著提高，但对热稳定性改善较弱。结构定位分析显示，提高热稳定性的突变主要位于冠域（crown domain），而提高活性表达的突变如I332V、E343Q、E455Q靠近同源二聚体界面。
以上结果说明，FCD和ASR方法可有效提高哺乳动物AP在大肠杆菌中的活性表达和热稳定性。热稳定性提升可能源于一致性效应改善核心堆积并降低祖先AP的环区动态。然而，提高活性表达需要多重突变的协同作用，单点突变无法达到与设计酶相当的可溶表达水平。热稳定性提升突变与活性表达改善突变在结构上分布不同，暗示这两种性质由不同的分子机制决定。冠域替换可提高热稳定性，与之前人肠AP冠域替换为胎盘AP冠域可提高热稳定性的研究一致；而二聚体界面附近的突变可能通过稳定同源二聚体形成来促进活性表达。
研究结论指出，利用聚类序列库结合FCD和ASR可以设计出具备更高热稳定性和大肠杆菌高效活性表达的哺乳动物AP。ASR在该研究中产生的AP在功能上优于采用相同序列库的FCD，表明整合MSA结果和系统发育树数据可减少库制备中的采样偏差。这些人工AP在诊断和分子生物学中具有更广泛的应用潜力，与昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统相比，大肠杆菌高活性表达提供了更经济的生产方式，显示出工业规模生产的优势。研究的亮点包括：成功将哺乳动物AP的T50提高超过13°C且未损失活性；复性效率提高两个数量级；揭示热稳定性与活性表达由不同氨基酸残基和结构区域调控；证明序列聚类对设计高功能酶的重要性。此外，作者还指出使用原核表达系统提升哺乳动物酶性质的潜在原因是ASR引入的一致性效应改善了核心结构，这对未来利用ASR进行酶设计策略具有重要意义。