研究背景与目的
内耳类器官（inner ear organoids, IEOs）作为研究神经感觉障碍和听力损失的体外模型，在发育生物学和转化医学中具有重要价值。然而，传统培养体系由于对早期类器官形态发生的控制不足，常导致类器官结构异质性高、成熟不完全以及可重复性差等问题。针对这一瓶颈，本研究团队提出了一种微地形工程策略，通过在初始聚集阶段施加时间受限的微尺度几何约束，系统探索早期生物物理信号对多能干细胞（pluripotent stem cells, PSCs）来源内耳类器官发育的长期影响。研究旨在证明早期微地形线索可作为具有指导性的调控因子，持久改善类器官的结构组织、可重复性和功能成熟，并进一步构建血管化内耳类器官平台，以拓展其在疾病建模和药物筛选中的应用。
本研究由Chonnam National University的Jangho Kim教授、Ajou University School of Medicine的Yun-Hoon Choung教授以及Pusan National University的Sunho Park教授联合团队完成，主要贡献者包括Harshita Sharma、Jungeun Lim、Woochan Kim和Yeon Ju Kim等。论文于2026年发表于*Advanced Materials*期刊。
研究设计与工作流程
研究团队首先设计并制备了微孔芯片平台。该平台采用基于软光刻的复模成型工艺，使用聚氨酯丙烯酸酯（PUA）作为中间模具材料，最终以聚二甲基硅氧烷（PDMS）浇铸成形。每个芯片包含225个直径500微米的半球形微孔，为细胞聚集提供确定的几何约束。该平台与传统U型底培养板的核心区别在于，细胞在初始聚集阶段受到主动的空间限制，而非依赖于被动沉降。
随后，研究者以小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells, mESCs）为对象，系统优化了初始接种密度。实验设置三种密度梯度（每孔2×10³、3×10³、4×10³个细胞，分别命名为MS-sph、MM-sph、ML-sph），在不施加离心的条件下进行聚集。结果显示，ML-sph组形成了最为致密且结构稳定的聚集体，其变异系数显著低于U型底培养组（2.8%对11.2%），表明微孔约束显著提高了聚集体尺寸的均匀性。免疫荧光分析进一步显示，ML-sph组中细胞骨架蛋白F-actin和整合素β4（ITGB4）的表达增强，提示上皮特性和细胞-基质相互作用得到改善。在添加Matrigel后，聚集体形成了致密的外周层，层粘连蛋白β1（LAMB1）表达上调，而多能性标志物OCT4水平下降，间隙连接蛋白Connexin 43（CX43）随时间增加，细胞周期蛋白Cyclin D1（CCND1）则减少，表明细胞向分化状态推进。通过对不同微孔约束时长（5天与10天）的比较，研究发现短期约束（5天）能维持更高的聚集体完整性，而长期约束（10天）在释放后导致结构完整性下降，由此确定了5天为最佳时间窗。活/死细胞染色证实微孔来源的聚集体细胞活力更高。
在确定优化条件后，研究者将mESCs和小鼠诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）分别按照已建立的逐步分化方案向IEOs诱导。小鼠方案持续30天，人类方案持续90天。在分化早期（第1–3天），微工程化小鼠内耳类器官（m-MIEOs）在Matrigel补充后维持了规则的球形形态，而U型底培养的对照类器官（u-MIEOs）则频繁出现不规则形态和部分碎裂。第5天的免疫荧光显示两组均向非神经外胚层状态推进，但m-MIEOs中标志物分布更为空间均匀。时间进程RT-qPCR分析揭示，m-MIEOs在LAMB1、GATA2、SIX1、PAX8、PAX2和JAG1等阶段相关基因的表达轨迹更为一致，表明谱系推进更为同步。至第14天，m-MIEOs形成了具有明确管腔结构的上皮囊泡样结构，PAX8和E-钙粘蛋白（E-cad）表达清晰，而u-MIEOs的上皮形态较为紊乱。第30天，免疫荧光显示m-MIEOs中MYO7A⁺区域比例显著高于u-MIEOs；RT-qPCR进一步证实ATOH1、MYO7A、ESPIN、PRESTIN、DNM3和OCM等感觉谱系相关基因表达上调。
为评估超微结构和功能特性，研究团队进行了系统的表征实验。透射电子显微镜（TEM）显示，m-MIEOs内细胞出现了顶端突起和具有特征性(9×2)+2微管排列的动纤毛样结构，且动纤毛长度显著大于对照组。FM1-43染料摄取实验显示m-MIEOs摄取量增加，提示存在具有机械敏感通道活性的毛细胞样群体。膜片钳记录中，从m-MIEOs解离的细胞表现出电压依赖性外向电流，电流密度高于u-MIEOs来源细胞；顺铂处理后两组电流密度均降低，但m-MIEOs仍保持较高水平，并伴随氧化应激（SOD2、NRF2）、炎症（STAT1、IL6）和凋亡相关（BCL2、BAX）基因的表达变化。
对hiPSCs来源的90天人类内耳类器官（hIEOs）进行的高分辨率共聚焦成像和正交重建显示，m-hIEOs中MYO7A⁺细胞优先定位于管腔面（顶端），SOX2⁺细胞位于其下方的邻近层，形成了更为有序的顶端-基底极性排列；三维表面重建进一步证实这些细胞群形成了更为连续的空间上皮域。多电极阵列（MEA）记录显示m-hIEOs具有更高的自发峰电位发放率，而电压门控钠通道阻断剂QX-314能显著抑制该活动，表明其具有钠通道依赖性电生理特性。
为解析分子机制，团队对第90天的u-hIEOs和m-hIEOs进行了全转录组测序（RNA-seq）。共检测到40,929个转录本，其中2,508个基因上调、2,710个基因下调。差异表达基因的KEGG通路富集分析突出了ECM-受体相互作用、黏着斑、PI3K-Akt、MAPK、Wnt信号通路及调控干细胞多能性的信号通路。与机械转导相关的基因网络在m-hIEOs中协调上调，包括整合素信号（ITGA1、ITGA5）、肌动蛋白细胞骨架重塑（MYH9、DIAPH2）、Hippo信号（WWTR1/TAZ、TEAD4）、细胞-ECM组织（FN1、COL1A2）、细胞间黏附（CDH11、JAM3）以及顶端连接/极性相关基因（PODXL、CDHR1）。同时，代表内耳发育各阶段的基因程序也呈现协调激活。RNAScope原位杂交进一步在组织空间层面验证了MYO7A和TUBB3信号的增强。
在血管化模型构建方面，研究团队将成熟的m-MIEOs与人内皮细胞（HUVECs）和周细胞样细胞（HBVPs）在富含层粘连蛋白的微流控芯片中共培养。该体系表现出紧密连接相关基因（CLDN1、OCLN、ZO-1）表达上调，共聚焦成像显示CD31⁺内皮网络与αSMA⁺周细胞样细胞空间关联，尽管连接蛋白定位呈异质性。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）处理后，内皮网络连续性降低、碎裂增加，SOX2⁺上皮域空间组织改变；使用TNF-α抑制剂英夫利西单抗（infliximab, IFX）可部分恢复网络连续性和上皮组织，表明该平台对炎症刺激和药物干预具有响应能力。
研究结论与价值
本研究系统证明了在早期聚集阶段施加的暂时性微地形约束能够持久增强PSCs来源IEOs的结构组织、可重复性和功能成熟。该效应在鼠源和人源系统中均得到验证，提示早期地形调控代表了多能干细胞类器官发育中的保守原理。转录组学证据表明，微地形约束通过激活黏着斑、整合素信号、Hippo和Wnt等机械转导通路，引发持续的发育程序重编程，最终促进感觉上皮的极化和毛细胞样群体的富集。
在应用层面，微工程化IEOs成功整合入血管化微流控平台，构建了血-迷路屏障样微生理模型，展现出对炎症扰动和药物干预的响应性。这为神经感觉疾病机制研究、耳毒性药物筛选以及个体化治疗策略的评估提供了更可靠的体外平台。研究还揭示，微地形调控并未驱动耳蜗与前庭谱系的选择性分化偏向，而是通过提升整体发育能力创造了一种容许性状态，后续可通过时空控制的形态发生素信号进一步实现亚型特化。
研究亮点
本研究的核心创新在于：其一，首次系统证明了暂时性（而非持续性）微地形约束对类器官长期发育的深远影响，并明确了时间窗的关键性；其二，将微工程策略从小鼠扩展至人类系统，建立了跨物种的普适性证据；其三，将类器官工程与微流控血管化技术结合，构建了具有炎症响应能力的血-迷路屏障样平台；其四，通过转录组学揭示了机械转导通路与内耳发育基因程序之间的协调激活，为理解生物物理信号如何转化为发育命运决定提供了分子框架。这些成果为类器官工程领域提供了可借鉴的策略范例，且该方法不依赖于复杂的基因操作或持续的生物材料支撑，具有较好的实用性和推广前景。