本研究是由Feng Liu和Wanxin Zhuang（共同第一作者）以及Chengjiang Gao（共同通讯作者）领导的研究团队完成的，团队成员来自山东大学等机构。该研究以研究文章（Research Article）的形式发表于PNAS期刊，发表于2026年2月20日，具体为第123卷第8期。
一、 研究背景与目标
本研究聚焦于免疫学与炎症领域，核心是探索一种名为NLRP3炎症小体的关键免疫复合物的调控机制。NLRP3炎症小体是细胞内感知危险信号并启动强烈炎症反应（如分泌白细胞介素-1β，IL-1β，并诱导细胞焦亡）的重要平台。虽然适度的炎症对宿主防御至关重要，但其过度激活与包括克罗恩病（Crohn’s disease）在内的多种炎症性疾病密切相关。然而，机体如何精确“刹车”以防止NLRP3炎症小体过度激活的具体分子机制尚不完全清楚。
此前，全基因组关联研究（GWAS）发现，位于3号染色体上的一个基因区域与克罗恩病风险增加相关，其中RNF123-R854H（一个单核苷酸多态性，SNP）被鉴定为候选致病变异。RNF123是一个E3泛素连接酶，但其在炎症性疾病中的作用未明。与此同时，另一个关键蛋白NEK7被确认为NLRP3炎症小体激活的“许可”因子：在静息状态下，NLRP3以笼状聚集体的形式自我抑制；NEK7通过与NLRP3结合，促使其解聚，从而暴露活性结构域，启动炎症小体组装。
基于以上背景，本研究旨在解决几个核心科学问题：1）克罗恩病相关的RNF123-R854H变异是否以及如何影响肠道炎症？ 2）RNF123是否调控NLRP3炎症小体的活性？ 3）如果调控，其具体的分子机制是什么？ 本研究的目标是揭示RNF123在NLRP3炎症小体调控和炎症性疾病中的新功能，并阐明其作用机制。
二、 详细研究流程
研究流程分为多个相互关联的部分，综合运用了体内动物模型、体外细胞实验和生物化学方法。
第一流程：验证RNF123与克罗恩病的关联及其体内功能。 * 研究对象： 构建了三种基因工程小鼠：野生型（Rnf123^wt^）、携带人类同源R854H突变的小鼠（Rnf123^R854H^）和RNF123基因敲除小鼠（Rnf123^-/^-）。每组小鼠在各项实验中通常有5-10只（如生存分析n=10，组织学分析n=5）。 * 处理与实验： 使用葡聚糖硫酸钠诱导小鼠实验性结肠炎模型。评估指标包括：生存率、体重变化、结肠长度、疾病临床评分。收集结肠组织进行苏木精-伊红染色评估病理损伤和评分；通过酶联免疫吸附测定检测结肠培养上清或组织中炎症因子（IL-1β, IL-18, TNF-α, IL-6）的水平；通过蛋白质免疫印迹检测Caspase-1和IL-1β的活化切割；通过半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳（SDD-AGE）检测接头蛋白ASC的聚集（炎症小体形成的标志）。 * 机制验证： 为了证明表型依赖于NLRP3，研究采用了两种方法：1) 在DSS模型中施用NLRP3特异性抑制剂MCC950；2) 将上述Rnf123突变/敲除小鼠与Nlrp3敲除小鼠杂交，获得双敲除小鼠（如Rnf123^-/^-Nlrp3^-/^-），并比较其结肠炎严重程度。
第二流程：探究RNF123在其他NLRP3驱动的炎症模型中的作用。 * 研究对象： 野生型、Rnf123^-/^-、Nlrp3^-/^-以及Rnf123^-/^-Nlrp3^-/^-双敲除小鼠。 * 处理与实验： 1. 内毒素血症模型： 腹腔注射脂多糖（LPS），监测生存率，检测血清中IL-1β等细胞因子水平，并分析腹腔灌洗液中细胞的Caspase-1/IL-1β切割和ASC聚集。 2. 腹膜炎模型： 腹腔注射NLRP3激活剂明矾（alum），检测腹腔灌洗液中IL-1β水平和免疫细胞（如中性粒细胞、单核细胞）募集情况，以及炎症小体活化标志。 3. 细菌感染模型： 鼻腔感染鲍曼不动杆菌（NLRP3依赖）或新凶手弗朗西斯菌（AIM2炎症小体依赖），监测体重变化、肺组织细菌负荷、肺部病理损伤、血清IL-1β水平以及肺组织中炎症小体活化情况。
第三流程：在细胞水平验证RNF123对NLRP3炎症小体的调控。 * 研究对象： 从小鼠分离的原代腹膜巨噬细胞、人单核细胞系THP-1、小鼠巨噬细胞系J774A.1和RAW264.7（以及过表达ASC的RAW-ASC细胞）。 * 处理与实验： 采用经典的“双信号”模型：先用LPS“启动”（priming），再用ATP、尼日利亚菌素（nigericin）或明矾等NLRP3激活剂刺激。 * 检测方法： * 功能丧失： 在Rnf123^-/^-巨噬细胞或通过siRNA敲低RNF123的THP-1细胞中，检测IL-1β和Caspase-1的切割与分泌（蛋白质免疫印迹和ELISA）、ASC聚集（SDD-AGE和免疫荧光斑点计数）、细胞焦亡（乳酸脱氢酶释放实验），以及炎症因子mRNA表达水平（定量PCR）。 * 功能获得： 在RAW-ASC细胞或重建了野生型/自身激活突变型（R258W）NLRP3的细胞中过表达RNF123，检测其对IL-1β分泌的抑制作用。 * 验证R854H突变： 比较Rnf123^R854H^与Rnf123^wt^小鼠来源的原代巨噬细胞在受到刺激后的炎症小体活化各项指标。
第四流程：阐明RNF123调控NLRP3的分子机制——靶向NEK7的泛素化。 * 蛋白质相互作用筛选： 纯化Flag标签的RNF123、NEK7、NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白，进行体外共免疫沉淀实验，发现RNF123特异性结合NEK7，而不直接结合其他炎症小体组分。在细胞（J774A.1、原代巨噬细胞）中通过免疫共沉淀和免疫荧光共定位验证了内源性RNF123与NEK7的相互作用。 * 鉴定泛素化类型： * 体内证据： 从Rnf123^wt^和Rnf123^-/^-巨噬细胞中免疫沉淀NEK7，使用泛素抗体、特异识别K63连接或K48连接泛素链的抗体进行检测，发现RNF123缺失显著降低了NEK7的K63连接泛素化信号。 * 体外证据： 在HEK293T细胞中过表达NEK7、RNF123及各种泛素突变体（如仅保留K63位点的泛素K63-Ub），免疫沉淀NEK7后发现，RNF123能显著增强NEK7的K63连接泛素化。 * 关键验证： 使用两种泛素链加工酶——ISOT（仅切割游离/非锚定泛素链）和VOTU（切割所有泛素链）处理免疫沉淀产物。发现ISOT和VOTU都能去除RNF123催化的NEK7泛素化信号，证明这是一种非锚定的K63连接泛素化，即泛素链并非共价连接在NEK7上，而是非共价结合。 * 体外重建实验： 使用纯化的E1酶、E2酶（UBE2N）、RNF123蛋白以及从细胞中免疫纯化的NEK7，在试管中成功重建了RNF123催化的、依赖于其E3活性的NEK7非锚定K63泛素化过程，并可被ISOT/VOTU去除。 * 突变分析： 构建RNF123的催化结构域缺失突变体（δRing）或锌指结构关键半胱氨酸突变体（3CA， 4CA），发现它们失去了催化NEK7泛素化的能力。构建NEK7的表面突变体（如mutR2， mutR3），发现它们与K63泛素链的结合能力以及被RNF123泛素化的程度均下降。
第五流程：探究NEK7捕获的K63泛素链对NLRP3炎症小体组装的直接影响。 * NEK7与泛素链的直接结合： 纯化NEK7、NLRP3等蛋白，与商业合成的K63连接四聚泛素链或更长链的K63泛素链进行体外结合实验，发现NEK7能特异性、高亲和力地捕获K63泛素链，且结合力强于NLRP3。通过分子对接和定点突变，确定了NEK7上负责结合泛素链的关键区域（如Region 2和3）。 * 功能抑制实验（体外重建）： 1. 结合抑制： 在含有纯化NEK7和NLRP3的体系中加入K63泛素链，能显著抑制两者的相互作用。 2. 解聚抑制： 通过蔗糖梯度超速离心分析NLRP3聚集体的状态。发现NEK7能促使大的NLRP3笼状聚集体解聚成小分子物种，而如果NEK7预先被RNF123泛素化修饰，或直接在反应体系中加入K63泛素链，则会阻碍这一解聚过程。 3. 组装抑制： 在包含NLRP3、ASC和NEK7的体外组装体系中，通过SDD-AGE检测ASC聚集。结果显示，RNF123催化的NEK7泛素化或外源性K63泛素链的加入，都能抑制NEK7许可的ASC寡聚化。 4. 结构可视化： 负染电子显微镜图像直观显示，NEK7能破坏NLRP3的环状结构，而K63泛素链（而非K48泛素链或单体泛素）能恢复NLRP3的规则形状，阻止NEK7的作用。 * 生理性泛素链的分离与验证： 从经LPS/ATP刺激的细胞中免疫沉淀NEK7，通过加热变性等方法将与之非共价结合的泛素链释放出来。将分离得到的“生理性”非锚定K63泛素链加入上述体外组装体系，证实其同样能抑制NEK7与NLRP3的结合及后续的炎症小体组装。
第六流程：揭示RNF123-R854H突变的功能缺陷机制。 * 实验： 在细胞过表达体系中比较野生型RNF123与R854H突变体催化NEK7泛素化的能力，发现R854H突变体此功能严重受损。 * 机制探究： 通过体外泛素化实验和免疫共沉淀实验发现，R854H突变不影响RNF123自身的泛素链合成活性及其与E2酶（UBE2N）的结合，但显著削弱了其与底物NEK7的相互作用。这导致该突变体无法有效将泛素链递送至NEK7，从而丧失了对NEK7-NLRP3相互作用和炎症小体组装的抑制作用。
三、 主要研究结果
RNF123缺失或R854H突变通过NLRP3依赖途径加剧结肠炎： 在DSS诱导的结肠炎模型中，Rnf123^R854H^和Rnf123^-/^-小鼠比野生型小鼠死亡率更高、体重下降更剧、结肠缩短更明显、病理损伤更严重，且结肠中IL-1β和IL-18水平显著升高，炎症小体活化标志（Caspase-1/IL-1β切割、ASC聚集）增强。使用MCC950抑制剂或敲除Nlrp3基因后，这种加重的表型完全消失，证明其依赖于NLRP3炎症小体。这为GWAS发现的RNF123-R854H变异是克罗恩病风险因子提供了直接的实验证据。
RNF123是NLRP3炎症小体的负调控因子，影响多种炎症模型： Rnf123^-/^-小鼠在LPS诱导的内毒素血症和明矾诱导的腹膜炎模型中，表现出更高的死亡率、更强烈的IL-1β分泌和更显著的炎症小体活化。在鲍曼不动杆菌感染中，Rnf123^-/^-小鼠清除细菌能力更强，肺部损伤更轻，伴随更高的IL-1β水平和炎症小体活化，表明其宿主防御增强。而在依赖AIM2炎症小体的弗朗西斯菌感染中则无差异。这些结果一致表明，RNF123在体内外均能负调控NLRP3炎症小体，其功能缺失导致炎症反应过度。
RNF123催化NEK7发生非锚定K63连接泛素化： 系列生化实验证实，RNF123作为E3连接酶，特异性催化NEK7（而非NLRP3、ASC等）发生泛素化修饰。这种修饰是K63连接类型的，并且是关键性的“非锚定”形式，即泛素链像“分子标签”一样非共价结合在NEK7上。
NEK7能直接捕获K63泛素链，该结合具有高亲和力和特异性： 体外实验首次证明NEK7蛋白本身具有直接、特异性结合K63泛素链的能力，其结合力强于NLRP3。通过结构建模和突变，鉴定出NEK7上的关键结合区域。
RNF123催化的NEK7泛素化及NEK7捕获的泛素链直接抑制NLRP3炎症小体组装： 机制核心在于，当NEK7被非锚定的K63泛素链“标记”或结合后，其与NLRP3的相互作用受到阻碍。具体表现为：1）NEK7与NLRP3的结合减弱；2）NEK7促使NLRP3笼状聚集体解聚的能力被抑制；3）最终导致ASC无法有效寡聚，炎症小体无法组装活化。这一系列体外重建实验清晰地勾勒出了“RNF123→催化NEK7非锚定K63泛素化→泛素链结合NEK7→空间位阻阻碍NEK7-NLRP3互作→抑制NLRP3解聚与组装”的完整分子通路。
RNF123-R854H突变通过削弱与NEK7的互作而丧失功能： 该突变位于RNF123的非催化区域，它不影响酶的催化活性，但损害了其与底物NEK7的结合能力，从而导致其无法对NEK7进行有效的泛素化修饰，最终失去了对NLRP3炎症小体的刹车功能。这解释了该SNP致病的分子基础。
四、 研究结论与意义
本研究得出核心结论：E3泛素连接酶RNF123通过催化NEK7发生非锚定的K63连接泛素化，使泛素链结合于NEK7并形成空间位阻，从而抑制NEK7与NLRP3的互作及其介导的NLRP3炎症小体组装，起到关键的“分子刹车”作用，维持免疫稳态。RNF123的功能缺失或克罗恩病相关的R854H突变会导致这一刹车失灵，引起NLRP3炎症小体过度活化，加剧肠道等组织的炎症，从而将RNF123与炎症性疾病的发病机制直接联系起来。
科学价值： 1. 发现新的关键调控因子： 首次将RNF123确立为NLRP3炎症小体的重要负调控因子，拓展了对炎症小体调控网络的认识。 2. 揭示全新的调控机制： 发现了“非锚定K63泛素化”这一非经典翻译后修饰在炎症小体调控中的关键作用，并阐明其通过空间位阻抑制蛋白-蛋白相互作用的精细机制，为泛素化调控提供了新范式。 3. 阐明疾病变异的功能基础： 从分子、细胞和动物整体水平，完整阐释了克罗恩病风险变异RNF123-R854H导致功能丧失、加剧炎症的因果链条，为GWAS发现提供了机制性解读。 4. 提出新的治疗靶点概念： 研究指出，靶向RNF123-NEK7-NLRP3轴，特别是增强RNF123功能或模拟非锚定泛素链的作用，可能成为治疗NLRP3过度活化相关疾病（如克罗恩病、自身炎症性疾病等）的新策略。
应用价值： 该研究不仅深化了对炎症性疾病发病机制的理解，也为开发基于此通路的新型抗炎药物提供了明确的靶点和理论依据。RNF123和NEK7均可被视为潜在的治疗靶标。
五、 研究亮点