本研究由河海大学环境学院的Xiao-Ying Zheng领衔，联合Dan Lu、Wei Chen等学者共同完成，发表于2017年8月的《Environmental Science & Technology》期刊（DOI: 10.1021/acs.est.7b02768）。研究聚焦环境科学与微生物工程交叉领域，探讨了氧化铜纳米颗粒（CuO NPs）长期暴露对好氧颗粒污泥（Aerobic Granular Sludge, AGS）在厌氧-好氧-缺氧（A/O/A）序批式反应器（SBRs）中脱氮除磷性能、酶活性及微生物群落的慢性毒性效应。

学术背景

氧化铜纳米颗粒（CuO NPs）因其独特物理化学性质被广泛应用于传感器、抗菌纺织品等领域，但其纳米尺寸效应和铜离子释放可能对生态系统产生毒性。污水处理系统中的活性污泥作为纳米颗粒的重要汇，其功能微生物易受毒性影响。现有研究多关注絮状污泥或生物膜对CuO NPs的短期响应，而AGS因其致密结构和功能分层特性可能表现出不同抗性机制。本研究首次系统评估了CuO NPs长期（90天）暴露对AGS系统的影响，旨在揭示：（1）污染物去除效率的变化规律；（2）关键酶活性响应机制；（3）微生物群落结构演变特征。

研究方法与流程

1. 实验系统构建

研究采用4组A/O/A-SBR反应器（有效容积7L），分别添加0（对照）、5、20、50 mg/L CuO NPs。CuO NPs（平均粒径50nm）经超声分散制备悬浮液，通过SEM和ICP-AES表征其形貌及铜离子释放量（图S1-S2）。接种AGS粒径为1.50mm，MLSS浓度3g/L，合成废水含COD（400mg/L）、NH₄⁺-N（50mg/L）、PO₄³⁻-P（10mg/L）等成分。运行周期为6小时（厌氧90min→好氧140min→缺氧116min），DO维持在5.0mg/L，温度20±3℃。

2. 分析指标与方法

• 污染物去除效率：每日监测COD、NH₄⁺-N、TN、TP，采用标准方法（APHA, 2005）测定。
  
• 关键酶活性：测定氨单加氧酶（AMO）、亚硝酸盐氧化还原酶（NOR）、硝酸盐还原酶（NR）、亚硝酸盐还原酶（NIR）等6种酶，采用分光光度法（文献15-16）。
  
• 毒性评估：通过活性氧（ROS）产量和乳酸脱氢酶（LDH）释放量反映氧化应激与细胞膜完整性（文献17-18）。
  
• 微生物群落：高通量测序（Illumina平台）分析16S rRNA基因V3-V4区，使用UPARSE聚类OTU（97%相似度），RDP分类器注释。
  

3. 创新方法

开发了长期暴露-功能响应-群落解析的三维评估框架：
（1）首次结合酶动力学与宏基因组学揭示CuO NPs对AGS脱氮除磷的分子机制；
（2）建立EPS（胞外聚合物）蛋白/多糖比值（PN/PS）作为毒性耐受性指标；
（3）采用EDX能谱定量AGS中CuO NPs吸附量（0.10-0.24%）。

主要结果

1. 污染物去除性能

• 氮去除：NH₄⁺-N去除率稳定在91%（图1a），而TN去除率在50mg/L CuO NPs组升至81.68%（对照76.09%），归因于Cu²⁺促进亚硝酸盐还原酶（CuNIR）和N₂O还原酶合成，减少NO₂⁻-N积累（图2a）。
  
• 磷去除：TP去除率随CuO NPs浓度升高显著下降（50mg/L组69.53% vs 对照77.46%），因PPK（聚磷酸激酶）和PPX（外切磷酸酶）活性抑制（图3b）。
  

2. 毒性机制

• 氧化损伤：50mg/L组ROS产量达对照的188.93%，LDH释放量增加335.94%（图4），表明细胞膜严重损伤。
  
• EPS防御：20mg/L组EPS中蛋白质（PN）含量升至105mg/gVSS（对照90mg/g），PN/PS比值提高，可能通过热休克蛋白缓解毒性（图5）。
  

3. 微生物群落

• 优势菌属：Zoogloea（43.28-57.90%）丰度随CuO NPs浓度增加而上升，体现抗性选择（图6）。
  
• 功能菌演变：脱氮菌Thermomonas（0.73%→3.78%）和Flavobacterium（0.27%→0.94%）丰度增加，而聚磷菌Acinetobacter丰度下降（表S1），与污染物去除趋势一致（图7）。
  

结论与价值

本研究首次阐明：
1. 科学价值：CuO NPs通过”铜离子辅助脱氮酶合成”与”磷酸酶抑制”的双路径机制，差异化影响AGS脱氮除磷功能；Zoogloea为核心的微生物网络是抗纳米毒性的关键。
2. 应用价值：为含纳米颗粒工业废水的生物处理工艺优化提供理论依据，建议控制CuO NPs浓度<20mg/L以维持系统稳定性。

研究亮点

• 方法创新：整合酶活性检测-高通量测序-EDX能谱的多尺度分析技术。
  
• 发现创新：揭示Cu²⁺对脱氮酶的激活作用，挑战了纳米颗粒仅具毒性的传统认知。
  
• 数据价值：提供90天长期暴露的完整动力学数据集（图1-7），填补AGS抗纳米毒性研究的空白。
  

其他发现

• 50mg/L CuO NPs导致EPS分泌崩溃（PN降至74mg/gVSS），提示超高浓度下AGS防御机制失效。
  
• 粒径分析显示CuO NPs促进AGS聚集（1.59mm→2.58mm），可能与胞外DNA吸附有关（图1g）。