肝素与艰难梭菌毒素相互作用表征及其作为抗CDI治疗药物的潜力研究

主要作者及研究机构：本研究由Fuming Zhang（伦斯勒理工学院化学与生物工程系）、Shaohui Wang（南佛罗里达大学莫尔萨尼医学院分子医学系）、Jiyuan Yang、Keith Fraser、James M. Gibson、Chunyu Wang、Jonathan S. Dordick、Anastasia Tomatsidou、Robert J. Linhardt、Lianchun Wang以及Xingmin Sun等学者合作完成。该研究发表于*Carbohydrate Polymers*期刊第351卷，文献编号123143，于2024年12月12日在线发表，2025年正式出版。

学术背景：艰难梭菌（*Clostridioides difficile*）是一种革兰氏阳性厌氧菌，能够产生毒素并形成芽孢，是导致艰难梭菌感染（CDI）的主要病原体。CDI通常作为抗生素使用的副作用出现，主要影响老年患者和免疫功能低下的人群，临床症状包括腹泻、发热、恶心和食欲减退。美国疾病控制与预防中心（CDC）已将CDI列为紧急威胁，2017年美国报告了约223900例CDI病例和12800例相关死亡。艰难梭菌的主要毒力因子为肠毒素A（TcdA）和细胞毒素B（TcdB），这两种毒素通过破坏结肠上皮细胞引发腹泻和炎症。TcdA和TcdB蛋白均含有四个功能结构域：N端葡萄糖基转移酶结构域、半胱氨酸蛋白酶结构域、负责受体结合和孔形成的中段递送结构域，以及C端组合重复寡肽（CROPs）结构域。CROPs结构域具有碳水化合物结合蛋白的特征，能够通过多种糖基部分介导毒素附着于细胞表面。

糖胺聚糖（GAGs）是一类线性阴离子多糖，包括硫酸乙酰肝素（HS）/肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸。GAGs广泛表达于哺乳动物细胞表面，通过与多种蛋白相互作用，介导病毒、细菌和真菌等多种病原体的附着与入侵。近期研究表明，硫酸化GAGs在TcdA的细胞进入过程中发挥重要作用，阻断GAG的硫酸化和合成可降低TcdA的结合和进入细胞的能力。因此，干扰毒素与GAGs相互作用的分子可能成为CDI治疗的新策略。目前CDI的一线治疗药物为口服甲硝唑或万古霉素，但二者均非完全有效，且复发率高，部分菌株对甲硝唑和万古霉素的敏感性显著降低。因此，开发新型CDI治疗药物具有迫切需求。本研究旨在利用表面等离子体共振（SPR）技术直接、实时、定量地分析艰难梭菌毒素与肝素之间的相互作用，为设计基于聚糖的抑制剂提供分子层面的关键信息。

研究流程与实验方法：本研究主要包括五个实验环节。第一环节为材料准备与试剂获取。猪肠肝素（16 kDa）和猪肠硫酸乙酰肝素（12 kDa）购自Celsus Laboratories；N-去硫酸肝素（14 kDa）、2-O-去硫酸肝素（13 kDa）和非抗凝肝素（NACH）在实验室中按照已发表的方法合成；6-O-去硫酸肝素（13 kDa）和肝素寡糖（聚合度从dp4到dp18）购自Iduron公司。SPR测量使用Biacore T200系统和Cytiva的评估软件完成，SPR传感芯片SA芯片同样购自Cytiva。

第二环节为TcdA和TcdB的表达与纯化。编码TcdA和TcdB的DNA序列来自艰难梭菌VPI10463菌株，被插入到巨大芽孢杆菌（*Bacillus megaterium*）表达载体pHis1525中，该载体在蛋白C端融合了His标签。蛋白通过镍亲和层析和离子交换层析从细菌裂解液中纯化获得，随后用SDS-PAGE进行分析确认。

第三环节为肝素SPR传感芯片的制备。采用改良的方案对肝素进行生物素化：将4 mg肝素和4 mg amine-PEG3-biotin溶解于400 μl蒸馏水中，加入20 mg氰基硼氢化钠启动反应，在70 °C下反应24小时，再加入10 mg氰基硼氢化钠继续反应24小时，随后使用3 kDa截留分子量的离心柱进行脱盐。生物素化肝素按照制造商方案固定在链霉亲和素芯片上，将100 μg/ml的生物素化肝素溶液以10 μl/min的流速注射至SA芯片的流动池2（Fc2），通过约200共振单位（RU）的增加确认固定成功。对照流动池（Fc1）通过1分钟饱和生物素注射制备。

第四环节为SPR动力学测量。将TcdA和TcdB分别以100、50、25、12.5和6.3 nM的浓度在HBS-EP缓冲液中制备，以40 μl/min的流速注射至肝素芯片表面。注射后使用HBS-EP缓冲液冲洗3分钟以促进解离，然后用40 μl的0.25% SDS再生芯片表面。结合响应随时间记录，温度为25 °C。SPR溶液竞争实验用于评估肝素链长和硫酸化模式对毒素-肝素相互作用的影响。将50 nM的TcdA或TcdB分别与1000 nM的全长肝素、肝素寡糖（dp4至dp18）或化学去硫酸肝素混合，以40 μl/min的流速注射至肝素芯片上。每组竞争实验均设置仅含蛋白的对照组，以确认芯片完全再生和结果的可比性。动力学参数通过T200评估软件使用1：1 Langmuir结合模型对全结合和解离阶段进行全局拟合获得。

第五环节为毒素介导的HeLa细胞变圆抑制实验。首先确定TcdA和TcdB引起细胞变圆的最低全效剂量，TcdA为5 ng/ml，TcdB为0.5 ng/ml。将HeLa细胞与给定浓度的TcdA或TcdB在存在或不存在肝素或NACH的条件下于37 °C培养过夜。使用BZ-X800显微镜捕获细胞图像，分析细胞图像以确定呈圆形形态细胞的百分比。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey多重比较检验，使用GraphPad Prism 9软件完成。

主要实验结果：蛋白表达与纯化方面，TcdA和TcdB在巨大芽孢杆菌中成功表达并通过镍亲和层析纯化，SDS-PAGE分析确认了蛋白的纯度。SPR直接结合实验显示，TcdA与肝素的结合亲和力（KD）为3.3 nM，TcdB与肝素的结合亲和力为13.5 nM，表明两种毒素均与肝素具有高亲和力结合，且TcdA的结合强度约为TcdB的四倍。动力学参数方面，TcdA的结合速率常数（ka）为1.06 × 10^5 1/Ms，解离速率常数（kd）为3.50 × 10^-4 1/s；TcdB的ka为3.32 × 10^4 1/Ms，kd为4.77 × 10^-4 1/s。TcdA表现出比TcdB更快的结合速率，而两者的解离速率相当。

SPR溶液竞争实验评估了肝素链长对毒素结合的影响。对于TcdA，所有测试的肝素寡糖（从dp4到dp18）对毒素-肝素相互作用均表现出弱到中等的抑制作用；对于TcdB，dp4至dp16的肝素寡糖表现出弱到中等的抑制作用，而dp18则表现出强抑制作用。对于两种毒素，全长肝素均能更有效地抑制毒素与肝素的相互作用，抑制率分别约为80%和90%。值得注意的是，四糖和六糖也表现出中等程度的抑制作用，这可能是因为蛋白上的部分结合区域对较短肝素寡糖具有更高的可及性。总体而言，TcdA和TcdB均偏好与较长的肝素链结合。

硫酸化模式的影响通过化学去硫酸肝素的竞争实验进行评估。结果显示，2-O-去硫酸肝素、6-O-去硫酸肝素和N-去硫酸肝素的抑制效果均显著低于未修饰的肝素，表明硫酸化所带的负电荷对肝素-毒素相互作用至关重要。

细胞实验方面，肝素和NACH均以剂量依赖的方式抑制TcdA介导的HeLa细胞变圆，在4 mg/ml浓度下几乎完全阻断细胞变圆。然而，肝素和NACH在4 mg/ml浓度下均不能抑制TcdB诱导的细胞变圆。这一差异可能是因为TcdA和TcdB利用不同的受体进入细胞，同时也表明肝素阻断TcdA细胞毒性的活性不依赖于其抗凝活性。

研究结论与意义：本研究通过SPR直接结合实验表征了肝素与艰难梭菌毒素之间的结合动力学和亲和力，TcdA和TcdB均表现出与肝素的强结合（KD分别为3.3 nM和13.5 nM）。利用不同链长的肝素寡糖进行的SPR竞争实验证明，TcdA和TcdB总体上均偏好较长链的肝素。化学修饰肝素衍生物的研究证实了硫酸化对于有效的肝素-毒素结合的必要性。体外细胞实验表明，肝素和NACH能够抑制TcdA在HeLa细胞中引起的细胞变圆。这些关于高效结合毒素所需结构特征的发现，为设计硫酸化聚糖抑制剂作为抗CDI治疗药物提供了分子层面的依据。

研究亮点：本研究的科学价值在于首次系统性地利用SPR技术定量表征了肝素与TcdA和TcdB的结合动力学和亲和力，揭示了链长和硫酸化模式对相互作用的影响规律，填补了肝素-艰难梭菌毒素分子相互作用定量数据的空白。在应用价值方面，研究发现非抗凝肝素NACH同样能够抑制TcdA介导的细胞毒性，这为开发不引起出血风险的非抗凝肝素类抗CDI治疗药物提供了实验依据，具有重要的临床转化潜力。研究方法上，SPR溶液竞争实验的应用能够精确解析聚糖结构特征与蛋白结合之间的关系，为糖胺聚糖-蛋白相互作用研究提供了有效的方法学参考。此外，研究还揭示了TcdA和TcdB在细胞进入机制上的差异，即肝素仅能阻断TcdA而不能阻断TcdB的细胞毒性，这一发现提示针对两种毒素可能需要不同的干预策略，为后续抗CDI药物的精准设计提供了重要线索。