二肽基肽酶3通过介导线粒体自噬和内在凋亡通路诱导心肌缺血再灌注损伤

主要作者与发表信息

该研究由Xiao Wang、Yaofeng Xie、Hongjiao Du、Cheng Chang、Chunyang Tian、Yuyao Yin、Xiaodong Li及Yilong Pan等人完成，通讯作者为Xiaodong Li和Yilong Pan，研究单位为中国医科大学附属盛京医院心血管内科。该研究发表于*European Journal of Pharmacology*第997卷，文章编号177592，于2025年4月4日在线发表。

学术背景

急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是心血管领域最危急的疾病之一，其特点是起病急骤、进展迅速，患者常在到达医院前即发生死亡。对于能及时到达医院的AMI患者，尽早恢复冠状动脉血流是首要治疗策略，其中经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention, PCI）是目前最有效的再灌注手段之一。然而，即便成功开通罪犯血管，心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI）仍可导致心肌细胞进一步死亡，成为影响PCI疗效和患者预后的关键因素。MIRI的病理机制极为复杂，迄今尚未完全阐明。

二肽基肽酶3（dipeptidyl peptidase 3, DPP3）是一种锌依赖性水解酶，属于金属肽酶M49家族，能催化含4–10个氨基酸残基的寡肽裂解为二肽。近年研究表明，DPP3在心血管疾病中扮演重要角色：其参与肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS）的调控，可高效水解血管紧张素，影响血压控制和心肌重塑；同时DPP3还参与氧化应激调节与炎症信号转导。多项临床研究发现，心源性休克患者血清DPP3水平显著升高，且与短期死亡率正相关，提示DPP3可能作为一种“心肌抑制因子”发挥作用。然而，DPP3在MIRI中的具体作用及其机制尚不清楚。

帕金森病蛋白7（Parkinson’s disease protein 7, PARK7），又称DJ-1，最初被鉴定为KRAS和ERK相关信号通路中的促癌蛋白，后来被证实是帕金森病的致病基因之一。PARK7是一种高度保守的蛋白，在抗氧化应激、维持线粒体功能、调控细胞凋亡以及促进PINK1/Parkin介导的线粒体自噬中发挥关键的细胞保护作用。氧化应激条件下，PARK7可转位至线粒体内膜，促进受损线粒体的清除，维持线粒体稳态；同时PARK7还能直接清除活性氧（reactive oxygen species, ROS）并激活Nrf2信号通路。已有研究表明PARK7在心肌缺血再灌注损伤中具有保护效应，但DPP3是否通过PARK7参与MIRI的病理过程仍是未知。

基于上述背景，本研究旨在利用体外细胞模型和体内小鼠模型，探索DPP3在MIRI发病机制中的潜在作用，并阐明其与PARK7的相互作用及相关信号机制。

研究流程

本研究包含体外实验和体内实验两大部分。体外实验以AC16人心肌细胞系为研究对象，采用氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/re-oxygenation, OGD/R）模型模拟MIRI。具体方法为：将AC16细胞培养于无糖DMEM/F12培养基中，在95% N₂和5% CO₂的缺氧条件下37°C培养12小时以模拟缺血，随后更换为含4.5 g/L葡萄糖的完全培养基，在正常条件下培养6小时以模拟再灌注。对照细胞则在正常培养基和标准条件下培养。

为探究DPP3的功能，研究者使用慢病毒载体对AC16细胞分别进行DPP3过表达、DPP3敲低、以及DPP3与PARK7同时敲低操作，并将细胞分为六个实验组：OGD/R+vector组、OGD/R+DPP3过表达组、OGD/R+NC阴性对照组、OGD/R+shDPP3敲低组、OGD/R+shDPP3+NC组，以及OGD/R+shDPP3+shPARK7同时敲低组。

在蛋白互作鉴定方面，研究者通过免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）联合质谱（mass spectrometry, MS）分析DPP3的蛋白质相互作用网络。实验设计包括四个IP组别：AA、BA、AB和BB，其中“A”和“B”分别表示使用IgG抗体和DPP3抗体进行免疫沉淀，“a”和“b”分别代表正常对照和OGD/R处理条件。通过比较各组特异性捕获的蛋白质，研究者筛选出DPP3的潜在相互作用蛋白，并进行基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析。随后，利用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）实验进一步验证DPP3与候选蛋白PARK7之间的直接相互作用。

在细胞凋亡检测方面，研究者通过Western blot（WB）和免疫荧光（immunofluorescence, IF）检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和裂解型caspase-3的表达水平，并使用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色检测细胞凋亡率。为了评估线粒体介导的内在凋亡通路，研究者使用线粒体提取试剂盒分离线粒体蛋白，通过WB检测线粒体细胞色素c（cytochrome c）的表达。细胞色素c从线粒体释放是内在凋亡通路的关键步骤，其线粒体表达下调提示凋亡通路的激活。

线粒体自噬方面，研究者检测了自噬相关蛋白p62、Beclin-1和LC3BII/I的表达水平。p62是自噬底物蛋白，其积累提示自噬流受阻；Beclin-1参与自噬体形成的起始；LC3BII/I比值反映自噬体的形成程度。同时利用透射电子显微镜观察线粒体形态和自噬体数量。此外，通过流式细胞术检测线粒体膜电位（使用TMRE探针）、细胞内钙离子浓度（使用Fluo-4AM探针）和ROS水平（使用DHE探针），并测定细胞内ATP含量。

在体内实验中，研究者使用40只8周龄雄性C57BL/6J小鼠，体重20±2 g，随机分为四组：假手术（sham）组、缺血再灌注（ischemia reperfusion, IR）组、IR+vector组和IR+shDPP3组。sham组和IR组小鼠适应性喂养三周。IR组小鼠通过结扎左前降支（left anterior descending, LAD）动脉45分钟后松开，再灌注24小时以建立I/R损伤模型。IR+vector组和IR+shDPP3组小鼠则通过尾静脉注射携带心肌细胞特异性启动子的腺相关病毒实现DPP3敲低，随后喂养三周。实验终点时，采用三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride, TTC）染色检测心肌梗死面积，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色观察心肌组织病理变化，动物超声评估心脏功能，包括左心室舒张末期内径（LVIDd）、左心室收缩末期内径（LVIDs）、左心室后壁舒张期厚度（LVPWd）、左心室后壁收缩期厚度（LVPWs）、射血分数（ejection fraction, EF）和左心室短轴缩短分数（fractional shortening, FS）。同时通过WB和酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测DPP3、PARK7及凋亡和自噬相关蛋白的表达水平。

主要研究结果

免疫沉淀联合质谱分析显示，在BB组（DPP3抗体+OGD/R处理）和BA组（DPP3抗体+正常对照）中分别特异检测到387个和823个DPP3相互作用蛋白，其中903个蛋白在两组中共同存在。GO和KEGG富集分析表明，这些互作蛋白富集于蛋白质稳定性、蛋白质互作、细胞质、细胞核、线粒体、代谢、神经退行性疾病和肌萎缩侧索硬化等相关通路。通过综合分析通路富集结果和质谱丰度，研究者发现PARK7是DPP3的潜在相互作用蛋白。Co-IP实验进一步验证了DPP3与PARK7之间的直接相互作用。

蛋白表达分析显示，OGD/R处理后DPP3蛋白表达上调，而PARK7表达下调。DPP3过表达进一步下调PARK7表达，DPP3敲低则上调PARK7表达，表明二者表达呈反向关系。同时敲低DPP3和PARK7后，DPP3表达较单纯DPP3敲低组有所回升，进一步证实了这种反向调控关系。

凋亡相关蛋白检测结果显示，OGD/R处理后Bax和裂解型caspase-3表达上调，Bcl-2表达下调，提示凋亡通路激活。DPP3过表达加剧了这些变化，而DPP3敲低则逆转了上述趋势，表现为Bax和裂解型caspase-3降低、Bcl-2升高。值得注意的是，同时敲低DPP3和PARK7并未保持DPP3单独敲低时的抗凋亡效应，反而进一步降低了Bax和裂解型caspase-3的表达并升高Bcl-2。然而，TUNEL染色显示，DPP3与PARK7同时敲低组的细胞凋亡率反而升高，说明PARK7的缺失削弱了DPP3敲低的保护作用。

线粒体细胞色素c的检测结果表明，OGD/R处理导致线粒体细胞色素c表达下调，DPP3过表达进一步加剧了这一变化，而DPP3敲低则可逆转该效应。同时敲低DPP3和PARK7后，线粒体细胞色素c表达反而上调，提示内在凋亡通路的复杂调控。

自噬相关蛋白方面，OGD/R处理后p62表达上调，Beclin-1和LC3BII/I表达下调，提示自噬流受阻。DPP3过表达放大了这些变化，而DPP3敲低则逆转了这些改变。同时敲低DPP3和PARK7进一步加剧了p62的积累和Beclin-1、LC3BII/I的下调。透射电子显微镜观察显示，OGD/R处理诱导了线粒体肿胀、嵴排列紊乱和自噬体出现。DPP3过表达增加了自噬体和受损线粒体的积累，DPP3敲低则减轻了这些改变，而同时敲低DPP3和PARK7则使这些损伤进一步恶化。

线粒体功能指标方面，OGD/R处理升高了细胞内钙离子浓度和ROS水平，降低了线粒体膜电位和ATP含量。DPP3过表达进一步加剧了这些变化，DPP3敲低则有效逆转了上述效应。同时敲低DPP3和PARK7增加了细胞内钙离子浓度和ROS水平，同时降低了细胞内ATP水平，表明PARK7缺失抵消了DPP3敲低对线粒体功能的保护作用。

体内实验中，WB和ELISA结果显示，IR处理上调了心肌组织中DPP3的表达，下调了PARK7表达，与体外结果一致。IR组中凋亡相关蛋白Bax和裂解型caspase-3上调、Bcl-2下调，DPP3敲低部分逆转了这些变化。自噬相关蛋白方面，IR处理后p62上调、Beclin-1和LC3BII/I下调，DPP3敲低同样逆转了这些改变。TTC染色显示，IR组心肌梗死区域呈苍白色，DPP3敲低显著缩小了梗死面积。HE染色显示，IR组心肌组织排列紊乱、细胞肿胀并伴大量炎症细胞浸润，DPP3敲低明显减轻了这些病理变化。动物超声评估显示，IR组LVIDs、LVPWd、EF和FS均出现异常改变，DPP3敲低可提高LVIDs、LVPWd、EF和FS，但对舒张功能指标无明显影响。

结论与研究价值

本研究首次证实了DPP3在MIRI发病中的关键作用及其机制：DPP3通过与PARK7相互作用，介导线粒体自噬和内在凋亡通路，从而加剧心肌缺血再灌注损伤。具体而言，DPP3过表达抑制了线粒体自噬、促进了线粒体损伤和细胞凋亡；而DPP3敲低则增强线粒体自噬、减轻线粒体功能障碍和细胞凋亡，改善心功能并缩小心肌梗死面积。同时敲低PARK7消除了DPP3敲低带来的保护效应，进一步证明PARK7是该过程中的关键下游分子。

本研究的科学价值在于揭示了DPP3-PARK7轴作为MIRI病理机制中一个新的调控节点，为理解MIRI的分子机制提供了新视角。在应用价值方面，研究表明靶向DPP3及其相关信号通路可能成为AMI再灌注治疗中减轻MIRI的潜在治疗策略，DPP3有望作为新的治疗靶点和生物标志物。

研究亮点

该研究的新颖性体现在以下方面：其一，首次鉴定了DPP3与PARK7的相互作用，建立了二者在MIRI中的功能联系；其二，系统阐明了DPP3通过调控线粒体自噬和内在凋亡通路参与MIRI的具体机制；其三，在体内外两个层面验证了DPP3敲低的心肌保护效应，并通过同时敲低PARK7实验证实了PARK7的必要性；其四，研究方法上结合了免疫沉淀-质谱联用、Co-IP、线粒体蛋白分离、流式细胞术和腺相关病毒介导的体内基因敲低等多种手段，形成了从分子互作到整体功能的完整证据链。

局限性

作者也指出了研究的局限性：首先，虽然证实了DPP3与PARK7之间的相互作用，但其具体作用机制仍有待进一步阐明；其次，体内基因敲低采用了腺相关病毒，如能使用转基因小鼠将进一步提高结果的准确性和可靠性。这些局限将在未来的研究中加以解决。