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双颜色RNA成像的研究进展：基于猝灭剂和荧光基团结合的适配体
主要研究人员
本研究由Heidelberg University的Ankita Arora、Murat Sunbul以及Andres Jäschke团队完成，研究发表于2015年7月14日的《Nucleic Acids Research》（DOI: 10.1093/nar/gkv718）。
背景与研究目的
RNA的功能和细胞内动态对于生命科学至关重要。然而，传统RNA成像方法受限于稳定性、交付难度和标记物体积等问题，难以满足活细胞多重RNA同步成像的需求。现有分子信标及基于GFP融合蛋白的方法虽然取得一定进展，但存在交付效率低和RNA功能干扰的问题。此外，荧光染料结合的适配体近年来被开发出来，但由于背景荧光过高，应用仍受限制。
本研究旨在通过设计一种模块化的小分子方法，实现细胞内RNA的多色成像。研究团队提出利用RNA适配体结合猝灭剂——二硝基苯胺（dinitroaniline, DN）——实现荧光增强的新策略，以解决现有技术局限。
研究流程与方法
实验设计
- 适配体筛选：研究采用体外进化技术（SELEX）筛选能够高效结合DN的RNA适配体。初始文库包含约2×10¹⁵个DNA分子，转录为RNA后经过多轮筛选、逆转录和PCR扩增，最终得到具备高结合力的适配体。
- 荧光探针开发：通过将DN与不同荧光基团（如荧光素、四甲基罗丹明、德州红等）结合，合成了一系列覆盖可见光谱的探针。这些探针在与适配体结合前被DN猝灭，结合后荧光显著增强。
- 数据测量与表征：采用光谱技术测定荧光量子产率，计算适配体与探针的解离常数（Kd），并验证其特异性和灵敏度。
- 活细胞实验：将适配体嵌入tRNA骨架中，通过大肠杆菌细胞表达系统验证RNA成像能力。分别使用不同颜色的荧光探针（如绿色的RG-DN、黄色的TMR-DN、红色的SR-DN）标记RNA。
实验结果
适配体筛选与优化
- 在多轮SELEX筛选后，研究发现一个名为DNB的适配体能够高效结合DN，并在与SR-DN结合时实现56倍的荧光增强，Kd约为0.8 μM。
- 优化后适配体DNB的熔解温度达到43°C，能够在生理温度下正确折叠并保持稳定。
荧光探针特性
- 开发的探针显示显著的荧光增强能力，其中TMR-DN与DNB结合后达到73倍的荧光提升。
- 各探针的量子产率（结合适配体后）显著高于未结合状态。
活细胞成像
- 成功在大肠杆菌细胞中使用DNB适配体实现RNA的多色成像，分别检测到绿色、黄色和红色荧光信号。
- 通过组合DNB适配体与另一个荧光基团结合的适配体（SRB-2），实现了两种不同RNA的双颜色成像，验证了系统的正交性。
研究结论
科学价值
本研究开发的基于猝灭剂结合适配体的RNA成像方法，为RNA研究提供了新工具： - 技术突破：采用猝灭剂结合策略克服了荧光基团绑定方法的背景荧光和数量限制问题。 - 应用广泛性：实验表明，该方法具有良好的灵敏度、特异性和生物相容性，可用于活细胞中RNA的动态定位及共定位研究。
应用潜力
- RNA分子交互：提供了探究RNA-RNA或RNA-蛋白交互的新方法。
- 多重成像：与其他成像系统（如MS2-GFP或Spinach）兼容，能够实现更多颜色的多重成像。
- 细菌细胞分区：揭示细菌细胞中RNA的功能性空间组织。
研究亮点
- 创新设计：首次将猝灭剂结合适配体与荧光探针结合用于RNA成像。
- 高效多色成像：实现了多种RNA同时检测，且无需清洗步骤。
- 灵活性：通过选择不同荧光基团，适应特定实验需求。
展望
未来研究可进一步优化系统灵敏度，利用重复适配体标签增强低丰度RNA的成像能力，并探索在其他细胞类型或复杂环境中的应用。