本文介绍了一项原创研究，该研究由上海中医药大学中西医结合研究院的戴畅、刘畅等学者完成，通讯作者为邹立伟、肖涟波和管晓庆。研究于2026年8月10日在线发表于学术期刊《Sensors and Actuators: B. Chemical》第468卷，文献编号140670。

这项研究属于化学生物学与医学诊断的交叉领域，主要聚焦于荧光RNA适配体（fluorescent RNA aptamer）生物传感技术的开发及其在类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）研究中的应用。RA是一种以慢性滑膜炎症和进行性关节破坏为特征的系统性自身免疫病。近年来，越来越多的研究表明，脂质代谢异常是RA发病机制中的关键环节，不仅影响巨噬细胞、T细胞和中性粒细胞的分化与功能，还通过脂滴异常积累、促炎脂质介质合成增加以及脂肪酸氧化失调等途径加重滑膜炎症和骨侵蚀。人羧酸酯酶1（human carboxylesterase 1, hCES1）是人体肝脏中主要的羧酸酯酶亚型，属于丝氨酸水解酶超家族，在药物代谢和内源性脂质底物水解中发挥双重功能，是维持脂质稳态的重要蛋白。然而，hCES1与RA发生发展的关系此前尚未被报道，且实时监测活体系统中hCES1活性的方法十分匮乏。因此，本研究的核心目标是开发一种能够实时、灵敏监测hCES1活性的新型生物传感平台，并将其应用于RA相关的细胞模型和临床样本分析。

研究的技术路线建立在荧光RNA适配体Pepper的基础上。Pepper是2019年由Chen等人通过SELEX筛选获得的荧光RNA适配体，能够特异性结合HBC系列荧光染料。与Spinach、Broccoli等早期荧光RNA适配体相比，Pepper具有更简单的折叠结构和更短的序列，对目标RNA的负担更小，在活细胞环境中表现出更高的稳定性和更低的错误折叠风险。本研究通过理性设计策略，对Pepper配体HBC530进行结构修饰，合成了一系列新型配体，并从中筛选出能够被hCES1特异性水解的荧光底物。该策略的关键创新在于将Pepper系统从静态的RNA成像工具转变为能够实时监测酶活性的动态生物传感器。

具体实验流程可分为以下几个主要环节。第一，配体的设计与合成。研究团队合成了六种HBC530衍生物，包括CDV、FHA、CHA以及CHA的甲酯、乙酯和苄酯（CHA-Me、CHA-Et、CHA-Bn）。其中CHA-Me的合成以4-(N-甲基-N-羟乙基)氨基苯甲醛和氰乙酸甲酯为原料，在哌啶催化下回流反应得到黄色固体，产率86.1%。CHA则通过CHA-Me在氢氧化钾存在下水解获得。CHA-Et和CHA-Bn分别通过CHA与乙醇或苄醇的酯化反应制备。所有化合物均经过核磁共振氢谱、碳谱和质谱确证结构。第二，分子对接研究。以Pepper适配体为受体，系统地阐明了系列配体的结合模式。结果显示，荧光增强主要依赖配体与Pepper中心口袋中G10、U40、G41和U42残基之间的π-π堆积相互作用，堆积距离是决定荧光强度的关键因素。与母体HBC530相比，CHA-Me、CHA-Et和CHA-Bn保持了相近的堆积距离，而CHA和FHA的堆积距离显著增加，解释了其荧光消失的原因。进一步以hCES1催化三聚体为受体的对接研究表明，只有CHA-Me既能与催化三聚体有效相互作用，又具有有利的计算结合能。第三，体外性能验证。荧光实验表明，1 μM CHA-Me与3 μM Pepper RNA结合时荧光信号最强，且CHA-Me与Pepper结合后的荧光强度是CHA的51倍，证实了该系统作为“关闭型”（turn-off）生物传感器的可行性。酶选择性实验证实CHA-Me可被重组hCES1特异性水解，而hCES1特异性抑制剂BNPP能显著抑制该水解反应。酶动力学分析显示，CHA-Me的水解过程遵循经典米氏动力学，Km值为0.52 μM，Vmax为1.75 nmol/min/mg蛋白，检测限为24.5 ng/mL，定量限为74.2 ng/mL。

第四，细胞水平的验证与应用。研究团队收集了Caco-2、HepG2、HEK293T和成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes, FLS）等多种细胞类型，通过CHA-Me/Pepper系统测定hCES1活性，并用ELISA测定hCES1蛋白浓度。结果显示HepG2细胞中hCES1活性最高，FLS细胞最低，且酶活性与蛋白浓度之间存在显著正相关。在活细胞成像实验中，稳定表达Pepper的Caco-2和HepG2细胞在加载CHA-Me后仅显示微弱绿色荧光，而共孵育BNPP后荧光显著增强，证实了该关闭型检测机制在活细胞中的适用性。第五，RA细胞炎症模型的建立与检测。研究使用TNF-α（10 ng/mL）和IL-17（10 ng/mL）联合刺激健康FLS细胞24小时，成功建立了模拟RA炎症微环境的体外模型。ELISA检测显示IL-1β和IL-6分泌分别增加约9.92倍和7.08倍。在此炎症条件下，hCES1的活性和蛋白表达均显著升高，并与炎症标志物呈正相关。高内涵成像进一步显示，TNF-α/IL-17刺激导致BODIPY标记的脂滴明显积累。第六，临床滑液样本的检测。研究首次将CHA-Me/Pepper系统应用于临床获取的膝关节滑液样本，以骨关节炎（osteoarthritis, OA）患者作为对照组，检测RA患者滑液中hCES1活性。结果显示，RA患者滑液中的hCES1活性和蛋白表达水平均显著高于OA患者，且所有受试者中hCES1蛋白水平与酶活性之间存在显著正相关。

本研究的主要结论是成功开发了一种基于Pepper适配体的新型RNA荧光生物传感平台，用于实时监测hCES1活性。该平台不仅在细胞水平验证了炎症条件下脂质积累与hCES1异常升高的伴随现象，还首次揭示了RA患者膝关节滑液中hCES1活性异常增高的事实。这些发现证实了脂代谢相关蛋白hCES1可能在RA的发生发展中发挥重要作用，为深入研究RA发病机制中脂质代谢紊乱提供了有价值的工具。

本研究的主要亮点包括：第一，在探针设计上实现了结构突破，突破了hCES1荧光底物传统设计理念中基于D-荧光素母核等结构的局限，提出了基于Pepper适配体系统的新型底物设计策略。第二，将Pepper系统从静态成像工具升级为动态生物传感器，实现了活细胞内hCES1活性的实时监测。第三，首次将基于Pepper的生物传感器应用于临床滑液样本，揭示了hCES1在RA患者中的异常升高，拓展了荧光RNA适配体在生物传感领域的应用范围。第四，研究在细胞和临床两个层面同时观察到脂质积累与hCES1异常升高的伴随现象，为理解RA中脂质代谢紊乱的病理机制提供了新的实验证据。