由中国北京生命科学研究所（北京蛋白质科学研究中心）张令强教授团队与刘翠华教授团队领衔，联合中国人民解放军总医院、河北大学、中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所、中国科学院微生物研究所等多家单位的研究人员共同完成了一项关于骨代谢调控的重要研究。该项研究成果以《OTUB1 promotes osteoblastic bone formation through stabilizing FGFR2》为题，于2023年发表在期刊 Signal Transduction and Targeted Therapy（影响因子：N/A，但作为Nature旗下子刊，具有高影响力）。

这项研究聚焦于骨稳态的分子调控机制，属于骨骼生物学与细胞信号转导的交叉领域。骨骼健康依赖于成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的动态平衡。失衡会导致多种骨骼疾病，如骨质疏松症。成纤维生长因子受体（FGFR）信号通路，特别是FGFR2，在骨骼发育和稳态维持中扮演着核心角色。然而，FGFR2蛋白水平的精确调控机制，尤其是在成骨细胞中的调控，尚不完全清楚。去泛素化酶（DUBs）是编辑或去除蛋白质泛素化修饰的关键酶，参与多种生命过程，但其在骨代谢中的功能研究相对匮乏。其中，OTU结构域去泛素化酶OTUB1此前被报道在癌症、免疫应答和肺发育中发挥作用，但其在骨稳态中的生理功能和分子机制完全是未知的。因此，本研究旨在探究OTUB1是否以及如何调控成骨细胞功能和骨形成，并阐明其潜在的分子机制，以期为骨质疏松等骨骼疾病的治疗提供新的靶点和策略。

研究的详细工作流程系统而严谨，主要包含以下几个核心部分：

1. OTUB1在骨形成中的生理功能验证：构建基因敲除小鼠模型并进行表型分析。 研究首先构建了OTUB1全身性敲除（OTUB1−/−）小鼠和成骨细胞特异性敲除（OTUB1 CKO）小鼠（通过与Osterix-Cre小鼠杂交实现）。对胚胎期（E14.5, E16.5, E18.5）和新生期（P0）的OTUB1−/−小鼠进行分析，发现其体长显著缩短，通过茜素红/阿尔新蓝骨骼染色发现其颅骨和四肢骨骼的矿化（骨形成）明显延迟。进一步的组织学分析（免疫荧光、Von Kossa染色）显示，敲除鼠股骨中早期成骨分化标志物Osterix（Osx）和晚期标志物I型胶原（Col1a1）表达下降，钙化状态显著减弱。重要的是，软骨细胞和破骨细胞的形成未受影响，表明表型特异于成骨细胞谱系。体外实验中，从敲除鼠颅骨分离的原代成骨细胞，其碱性磷酸酶（ALP）染色（分化标志）和茜素红S（ARS）染色（矿化结节标志）严重受损，多种成骨标志基因（ALP, Col1a1, Ocn, Osx）的mRNA水平显著下降，而增殖能力无变化。这初步证实了OTUB1是成骨细胞分化和矿化所必需的。

2. 成骨细胞特异性敲除小鼠的表型深化与骨量评估。 对成年（4周和8周）OTUB1 CKO小鼠的分析显示，它们出现了明显的骨量丢失和骨骼强度下降。显微计算机断层扫描（micro-CT）分析揭示，与对照组相比，CKO小鼠股骨的骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和厚度（Tb.Th） 均显著降低，骨小梁分离度（Tb.Sp） 增加。三点弯曲实验证实其胫骨的最大载荷和刚度显著降低。组织形态计量学显示，CKO小鼠的成骨细胞数量/骨表面（N.Ob/BS） 和血清骨形成标志物PINP水平下降，而钙黄绿素双标实验显示其矿化沉积率（MAR） 减慢。相反，骨吸收标志物CTX-1水平和破骨细胞表面/骨表面（Oc.S/BS）无显著变化。这些体内外证据一致表明，OTUB1特异性通过促进成骨细胞介导的骨形成来维持骨量，而不影响骨吸收。

3. 机制探索：发现FGFR2是OTUB1的关键下游靶标。 为了揭示机制，研究对野生型和OTUB1敲除的成骨细胞进行了RNA测序（RNA-seq）。基因本体（GO）和KEGG通路分析显示，差异表达基因显著富集于PI3K-Akt和MAPK信号通路，而受体酪氨酸激酶（RTK）相关通路中，FGF信号通路富集程度最高。蛋白免疫印迹分析发现，在OTUB1缺失的成骨细胞和骨髓间充质干细胞（BMSCs）中，FGFR2的蛋白水平显著下降，而其mRNA水平不变，提示OTUB1在翻译后水平稳定FGFR2。此外，在OTUB1敲除的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中，FGFR2配体FGF10刺激下游的Akt和ERK磷酸化激活被延迟。

4. 分子机制解析：OTUB1如何稳定FGFR2。 通过免疫共沉淀（Co-IP） 和GST Pull-down实验，证实了OTUB1与FGFR2存在直接相互作用，该相互作用依赖于OTUB1的N端UBA结构域。进一步的泛素化实验显示，OTUB1缺失导致FGFR2的泛素化水平增强。通过使用特定赖氨酸位点保留的泛素突变体，发现OTUB1主要抑制Lys11和Lys48连接的多聚泛素链（与降解相关）在FGFR2上的形成。有趣的是，OTUB1抑制FGFR2泛素化的能力并不依赖于其催化核心残基（C91和H265），而是依赖于其E2结合位点（D88）。这表明OTUB1采用了非典型机制，即通过占据E2结合位点，干扰E2与E3的连接，从而抑制泛素链的合成，而非直接切割泛素链。蛋白稳定性实验（环己酰亚胺CHX处理）证实，OTUB1缺失显著缩短了FGFR2的半衰期。使用溶酶体抑制剂氯喹（CQ），而非蛋白酶体抑制剂MG132，能够恢复OTUB1敲除细胞中FGFR2的蛋白水平和泛素化积累，表明OTUB1通过抑制其溶酶体降解途径来稳定FGFR2。

5. 鉴定调控FGFR2泛素化的E3连接酶：SMURF1。 通过生物信息学工具Ubibrowser预测并结合实验验证，研究发现HECT家族E3泛素连接酶SMURF1能够特异性结合并泛素化FGFR2，而经典的FGFR调控因子Cbl则不能。SMURF1的过表达促进FGFR2降解，且该降解可被CQ抑制。在机制上，OTUB1的过表达可以阻断SMURF1与其协作E2（Ubch5c）之间的相互作用，但不影响SMURF1与底物FGFR2的结合，从而抑制了SMURF1催化的FGFR2泛素化。在SMURF1基因敲除（Smurf1−/−）小鼠的骨组织和成骨细胞中，FGFR2的泛素化水平降低，蛋白水平升高，且FGF10刺激下的下游信号增强。这确立了OTUB1-SMURF1-FGFR2调控轴的存在：OTUB1通过干扰SMURF1与E2的结合，抑制SMURF1介导的FGFR2过度泛素化及随后的溶酶体降解，从而维持FGFR2的稳定性和信号传导。

6. 功能挽救实验：在体回补FGFR2或OTUB1逆转表型。 为了证明FGFR2的下调是OTUB1缺失导致骨表型的主要原因，研究使用了腺相关病毒血清型9（AAV9） 递送系统，该载体被证明能高效转导成骨谱系细胞。将AAV9-FGFR2局部注射到OTUB1 CKO小鼠的膝关节腔。两个月后，micro-CT和组织学分析显示，FGFR2的回补显著挽救了CKO小鼠的骨量丢失，提高了BMD、BV/TV等参数，并恢复了成骨标志基因的表达。这直接证明了FGFR2是OTUB1下游的关键效应分子。 鉴于OTUB1在成骨中的正向作用，研究进一步探索了其治疗潜力。发现在卵巢切除（OVX）诱导的骨质疏松小鼠模型以及自然衰老小鼠的骨组织中，OTUB1的mRNA水平显著下调。向OVX小鼠的膝关节注射AAV9-OTUB1，能有效减轻其骨量丢失，改善骨骼生物力学性能，并提升成骨相关基因的表达，而对破骨相关基因无影响。这表明通过局部上调OTUB1水平来促进成骨，是缓解骨质疏松的一种潜在治疗策略。

本研究的结论清晰而有力：OTUB1是骨稳态的正向调控因子。它通过其UBA结构域与FGFR2结合，并以一种非催化依赖的方式，干扰E3连接酶SMURF1与E2 Ubch5c的相互作用，从而抑制SMURF1介导的FGFR2 K11/K48多聚泛素化及随后的溶酶体降解。在成骨细胞中，OTUB1通过稳定FGFR2蛋白，确保其下游PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路的正常传导，进而促进成骨细胞分化、矿化和骨形成。OTUB1的缺失导致FGFR2过度降解、信号减弱，最终引发成骨障碍和骨质疏松样表型。在骨质疏松状态下，OTUB1表达下调可能参与了疾病进程，而恢复其表达则显示出治疗潜力。

这项研究的科学价值与应用价值重大。在科学上，它首次揭示了OTUB1在骨骼系统中的关键生理功能，拓展了OTU家族去泛素化酶的生物学作用谱；阐明了FGFR2蛋白稳定性调控的一种全新机制，即由OTUB1和SMURF1构成的精细调控模块，这为理解受体酪氨酸激酶的周转调控提供了新视角；提出了OTUB1通过非典型（不依赖其酶活性）的“E2竞争”机制抑制底物泛素化的又一个有力例证。在应用上，该研究将OTUB1确立为促进骨形成的潜在治疗靶点。研究证实，利用AAV9载体局部递送OTUB1或FGFR2，能有效缓解基因敲除或OVX导致的骨丢失，这为开发针对骨质疏松、骨折不愈合等骨骼疾病的靶向成骨细胞的基因治疗或药物干预策略提供了全新的思路和实验依据。

本研究的亮点突出：首先，研究目标新颖，首次系统探究了OTUB1在骨代谢中的功能，填补了领域空白。其次，机制解析深入且完整，从整体动物表型到细胞功能，再到分子互作和生化机制，逻辑链条严密，逐步揭示了从OTUB1到FGFR2稳定性，再到下游信号和最终成骨功能的完整调控通路。第三，非典型机制的阐明，发现了OTUB1不依赖其去泛素化酶活性，而是通过竞争性抑制E2-E3相互作用来稳定FGFR2，深化了对OTUB1功能多样性的认识。第四，强大的在体验证，不仅使用了条件性基因敲除模型，还通过AAV9介导的基因回补实验，在体证明了FGFR2是OTUB1的关键下游效应分子，并成功进行了概念性治疗验证（治疗OVX骨质疏松），使研究结论非常坚实，且具有明确的转化医学前景。第五，多层面技术整合，综合运用了遗传学（多种基因工程小鼠）、影像学（micro-CT）、组织形态计量学、分子生物学（RNA-seq， Co-IP， 泛素化分析）、细胞生物学和病毒载体技术，展现了全面的研究手段。

此外，研究中还有两点值得注意：一是研究排除了OTUB1同源蛋白OTUB2在骨形成中的冗余作用，突出了OTUB1功能的特异性；二是研究明确区分了FGFR2的降解途径是溶酶体途径而非蛋白酶体途径，并发现了不同于经典Cbl通路的新E3（SMURF1），这加深了对FGFR2代谢命运的理解。

这项由张令强和刘翠华团队领导的研究，是一项从基础到转化、机制清晰、证据充分的优秀工作。它不仅揭示了OTUB1-FGFR2轴在维持骨稳态中的核心作用，更重要的是为骨质疏松等疾病的治疗开辟了一条通过增强成骨细胞功能来促进骨形成的新途径，具有重要的理论意义和广阔的临床应用潜力。