关于“通过ABPP和MS-CETSA联合反卷积策略鉴定氯喹抗疟靶点”的学术研究报告
一、 研究团队、发表期刊与时间 本研究的主要作者包括Gao Peng, Liu Yan-Qing, Xiao Wei等人，其所属机构为中国中医科学院中药研究所青蒿素研究中心、暨南大学第二临床医学院、南方科技大学第一附属医院深圳市人民医院老年医学科等。该研究成果以《Identification of antimalarial targets of chloroquine by a combined deconvolution strategy of ABPP and MS‑CETSA》为题，于2022年发表在学术期刊*Military Medical Research*（第9卷第30期）上。该期刊文章遵循知识共享许可协议（CC BY 4.0），为开放获取（Open Access）文章。
二、 研究背景与目标 本研究属于疟疾治疗药物作用机制研究领域，具体聚焦于经典抗疟药物氯喹（Chloroquine, CQ）的作用机理探索。
学术背景： 疟疾至今仍是严重威胁发展中国家公共卫生的致命性传染病。氯喹在人类抗击疟疾的历史中曾扮演了不可或缺的角色，其成本低廉、耐受性良好。然而，尽管经过数十年的广泛研究，氯喹确切的抗疟作用机制（Mechanism of Action, MoA）仍未完全阐明。传统观点认为，氯喹作为一种弱碱，在疟原虫消化泡（Digestive Vacuole, DV）的酸性环境中被质子化并富集，通过抑制有毒血红素聚合成疟色素（Hemozoin）的过程，并可能通过与游离血红素结合破坏消化泡膜，从而杀死疟原虫。然而，这一经典机制可能并非氯喹发挥抗疟作用的全部图景。此外，随着疟原虫（尤其是恶性疟原虫*Plasmodium falciparum*）对氯喹的耐药性日益普遍和扩散，深入理解其分子层面的作用靶点，对于应对耐药性和开发新疗法具有重要意义。
研究目标： 本研究旨在超越传统的“疟色素抑制”理论，采用系统性的蛋白质组学方法，全面、无偏地鉴定氯喹在疟原虫内的直接蛋白质靶点，以期发现其未知的抗疟作用机制，为理解氯喹作用方式、应对耐药性以及拓展其临床应用提供新的视角和靶点。
三、 详细研究流程与方法 本研究采用了两种互补的蛋白质组学技术——基于活性的蛋白质组学分析（Activity-Based Protein Profiling, ABPP）和质谱联用细胞热位移分析（Mass Spectrometry-Coupled Cellular Thermal Shift Assay, MS-CETSA），形成了一套联合反卷积策略，以高置信度鉴定氯喹的靶点。
第一流程：氯喹类似物探针（CQP）的设计、合成与验证 1. 探针设计： 研究者基于光亲和标记和点击化学原理，设计并合成了一个具有光反应活性的氯喹类似物探针（Chloroquine analog probe, CQP）。该探针保留了氯喹抗疟活性所必需的喹啉环、7-位氯原子和末端氨基，同时引入了光交联基团（二苯甲酮类似物）和末端炔基。 2. 化学合成： 通过多步有机合成路线，成功制备了CQP。具体步骤包括从1,4-二溴戊烷出发，经亲核取代、氢化、Boc保护、与4,7-二氯喹啉缩合、脱保护、还原胺化、酯化、叠氮取代，最终通过点击化学反应连接二炔基光亲和基团（详细合成路线见补充材料）。 3. 探针功能验证： * 抗疟活性验证： 使用SYBR Green I荧光法测定CQP对氯喹敏感的恶性疟原虫3D7株的体外抑制活性。结果显示，CQP的半抑制浓度（IC50）在纳摩尔级别，与氯喹相当，证明修饰后的探针保留了母体化合物的核心抗疟活性。 * 标记能力验证（体外与原位）： * 体外标记： 将疟原虫裂解液与不同浓度的CQP孵育，经紫外（UV, 365 nm）照射激活光交联后，通过铜催化的叠氮-炔环加成反应（Click Chemistry）连接TAMRA荧光标签。SDS-PAGE电泳及荧光扫描显示，寄生虫蛋白的荧光标记呈CQP剂量依赖性，且UV照射是必需的。 * 原位标记： 在感染红细胞（iRBCs）中活的疟原虫上进行同样操作，结果与体外一致。 * 竞争性实验： 在加入CQP前，用过量氯喹预处理疟原虫裂解液或活虫，可显著减弱CQP引起的荧光标记信号，证明CQP与氯喹共享相同的蛋白结合位点。 * 细胞内分布： 共聚焦显微镜成像显示，CQP能累积在疟原虫内部，且其信号可被过量氯喹竞争性消除。
第二流程：基于ABPP策略的靶点鉴定 此流程利用已验证的CQP探针，通过亲和富集和定量蛋白质组学，系统性地“钩钓”与氯喹直接相互作用的蛋白质。 1. 样品处理： 制备恶性疟原虫3D7株的裂解液。 2. 实验分组： 设立三组：（1）CQP处理组；（2）DMSO溶剂对照组；（3）氯喹竞争组（先用过量氯喹预处理，再加CQP）。 3. 光交联与生物素标记： 各组样品与CQP孵育后，进行UV照射。随后通过点击化学反应，将生物素标签连接到被CQP交联的蛋白质上。 4. 亲和纯化与酶解： 使用链霉亲和素磁珠富集生物素标记的蛋白质。洗涤后，在磁珠上进行蛋白质的变性、还原、烷基化，并用胰蛋白酶进行胶内酶解。 5. 肽段标记与质谱分析： 将酶解得到的肽段使用TMT10plex同位素标签进行标记，混合后通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行定量分析。 6. 数据分析： 使用Proteome Discoverer软件进行数据库搜索和定量分析。通过比较CQP组与对照组、CQP组与竞争组的蛋白质丰度，筛选出被CQP特异性光交联、且信号可被氯喹竞争性抑制的蛋白质作为高置信度候选靶点。最终，通过严格的统计学标准（倍数变化≥1.2，校正后p值<0.05），鉴定出40个特异性相互作用蛋白。
第三流程：基于MS-CETSA策略的靶点鉴定 此流程是一种无需探针修饰、基于药物结合引起靶蛋白热稳定性变化的“无标记”靶点发现方法。 1. 原理： 当药物与靶蛋白结合时，通常会改变该蛋白的热稳定性（增强或减弱）。通过在不同温度下加热药物处理过的裂解液，沉淀去折叠蛋白，保留可溶蛋白，即可通过质谱定量检测药物浓度梯度下各蛋白的热稳定性变化曲线。 2. 实验设计： 制备疟原虫裂解液，与一系列浓度梯度（0-300 µM）的氯喹孵育。 3. 热挑战： 每个药物浓度的样品分成三份，分别在37°C（非变性对照）、52°C和61°C下加热。 4. 样品制备与质谱分析： 加热后离心取上清（可溶蛋白部分），进行蛋白质酶解，肽段同样使用TMT标记，并通过LC-MS/MS进行定量分析。 5. 数据分析： 使用专门开发的R软件包（minecetsa）分析数据。通过评估每个蛋白质在氯喹浓度梯度下的热稳定性变化曲线（以曲线下面积AUC等参数衡量），并应用一系列严格标准（如δAUC > 3倍中位绝对偏差、最大折叠变化≥1.3、剂量-响应曲线拟合优度R² ≥ 0.85等），从总共检测到的3375个寄生虫蛋白中，鉴定出83个热稳定性发生显著变化的候选相互作用蛋白。
第四流程：交叉验证与靶点确证 为确保结果的可靠性，研究者对两种方法共同鉴定出的靶点进行重点验证。 1. 靶点交集： 将ABPP鉴定的40个蛋白与MS-CETSA鉴定的83个蛋白取交集，得到了8个被两种独立方法共同识别的高置信度潜在靶点蛋白。 2. 生物信息学分析： 对共同靶点进行基因本体（GO）富集分析，发现这些蛋白显著富集于糖酵解和能量代谢相关通路。 3. 分子对接模拟： 针对其中5个与糖酵解/能量代谢相关的关键酶——乳酸脱氢酶（PfLDH）、鸟氨酸氨基转移酶（PfOAT）、丙酮酸激酶（PfPyrK）、磷酸甘油酸激酶（PfPGK）和磷酸丙糖异构酶（PfTPI），进行了分子对接模拟。结果显示，氯喹分子能够结合在这些酶的底物/活性位点口袋或附近，提示结合可能具有功能相关性。 4. 重组蛋白体外结合验证： * 在大肠杆菌中成功表达并纯化了上述5种重组疟原虫蛋白。 * 使用CQP探针进行体外光交联实验，证实CQP能以剂量依赖且UV光照依赖的方式与这些重组蛋白共价交联，且该结合可被过量氯喹竞争。 * 通过表面等离子体共振（SPR）技术直接测量氯喹与这5种蛋白的结合动力学，获得了低微摩尔级别的解离常数（Kd值在0.32 µM 到 1.95 µM之间），证实了直接的物理相互作用。 5. 寄生虫原位结合验证： 用CQP处理活寄生虫，UV照射后，裂解细胞并通过点击化学连接生物素，进行下拉（Pull-down）实验，随后用蛋白质印迹（Western Blot）检测。结果证实，这5种内源蛋白在寄生虫内能被CQP特异性下拉，且该作用可被氯喹预处理抑制。 6. 酶活性抑制验证： 在体外酶活实验中，氯喹能以剂量依赖的方式显著抑制这5种重组酶的催化活性，证明了氯喹结合的功能性后果。 7. 亚细胞共定位： 通过免疫荧光共聚焦显微镜观察，发现CQP探针在寄生虫内与这5种靶蛋白以及线粒体标记物（MitoTracker）存在显著的共定位，进一步支持了氯喹在线粒体相关能量代谢通路中的作用位点。
四、 主要研究结果 1. 成功开发功能性氯喹光亲和探针（CQP）： 合成并验证了CQP，其保留了氯喹的核心抗疟活性和细胞内积累特性，同时具备了光交联和点击化学标记功能，为后续ABPP研究奠定了基础。 2. ABPP鉴定出40个特异性氯喹相互作用蛋白： 通过探针介导的亲和富集与定量蛋白质组学，无偏地发现了40个与氯喹存在特异性光交联作用的疟原虫蛋白，这些相互作用可被游离氯喹竞争。 3. MS-CETSA鉴定出83个热稳定性受氯喹影响的蛋白： 通过无标记的热稳定性分析，独立发现了83个蛋白的热稳定性随氯喹浓度发生显著变化，提示它们可能与氯喹直接或间接相互作用。 4. 发现8个高置信度共同靶点，指向糖酵解与能量代谢通路： 两种方法交集产生了8个最可靠的潜在靶点。GO富集分析强烈提示，氯喹的作用涉及干扰寄生虫的糖酵解和能量代谢过程。这是对传统“疟色素抑制”机制的重要补充。 5. 确证5个关键代谢酶为氯喹的直接功能靶点： 对PfLDH、PfOAT、PfPyrK、PfPGK和PfTPI这5个酶的深入验证表明：（a）氯喹能以低微摩尔亲和力直接结合这些酶；（b）结合发生在酶分子上；（c）结合可抑制酶的催化活性；（d）在活体疟原虫内，氯喹探针能与这些内源靶点共定位。 6. 提出氯喹抗疟新机制： 综合以上结果，本研究揭示氯喹能够通过直接结合并抑制糖酵解和能量代谢途径中的关键酶，来破坏疟原虫的能量供应，这构成其抗疟作用的一个先前被忽视的新机制。
结果间的逻辑关系： CQP的合成与验证（结果1）是进行ABPP（结果2）的前提。ABPP和MS-CETSA作为两种原理互补的技术，各自独立产生候选靶点列表（结果2和3）。两者结果的交集（结果4）极大地提高了靶点发现的可信度。随后，对交集靶点中的关键代谢酶进行多层次验证（结果5），从计算模拟、体外结合、酶活抑制到原位验证，形成了完整的证据链，最终支持并深化了新机制的提出（结果6）。整个流程从探针开发到多技术验证，环环相扣，逻辑严谨。
五、 研究结论与意义 结论： 本研究发现，氯喹除了已知的抑制疟色素形成的作用外，还能通过直接结合并抑制疟原虫糖酵解和能量代谢途径中的关键酶（如PfLDH、PfOAT、PfPyrK、PfPGK、PfTPI），破坏寄生虫的能量代谢，从而发挥抗疟作用。这是首次通过并行使用标记（ABPP）和无标记（MS-CETSA）方法联合鉴定氯喹的抗疟靶点。
科学价值： 1. 深化机制理解： 突破了长期以来对氯喹作用机制局限于消化泡内过程的认知，揭示了其在细胞质代谢通路中的直接作用靶点，为全面理解氯喹的抗疟活性提供了更完整的图景。 2. 提供新的研究方向： 指出寄生虫的糖酵解和能量代谢途径是抗疟药物研发的潜在重要方向。所鉴定的5个靶点酶可能成为未来开发新药或克服耐药性的新靶标。 3. 方法学贡献： 建立并验证了ABPP与MS-CETSA联合使用的强大策略。该策略结合了两种技术的优势（ABPP的共价捕获特异性和MS-CETSA的无标记、基于生物物理性质的原位探测能力），提高了靶点发现的覆盖率和可信度，为其他药物作用机制研究提供了可借鉴的范例。
应用价值： 1. 应对耐药性： 新机制的发现有助于解释某些氯喹耐药现象，并可能启发基于新靶点的联合用药策略，以延缓或克服耐药性。 2. 药物重定位启示： 氯喹及其衍生物羟氯喹也用于治疗自身免疫性疾病。本研究建立的技术和方法，可指导探索这些药物在非疟疾适应症中的作用机制。 3. 工具与数据资源： 开发的CQP探针和相关实验流程是后续研究的有力工具。所产生的大规模蛋白质组学数据也为疟疾研究领域提供了宝贵资源。
六、 研究亮点 1. 重要的科学发现： 首次系统性地鉴定出氯喹在疟原虫内的一系列直接蛋白质靶点，并揭示了其通过干扰能量代谢发挥抗疟作用的新颖机制，是对经典理论的重要补充和拓展。 2. 方法学的创新性与严谨性： 创新性地将ABPP（化学蛋白质组学）和MS-CETSA（生物物理蛋白质组学）两种前沿技术平行应用、相互验证，形成了强大的联合反卷积策略。这种多技术交叉验证极大地提高了靶点鉴定结果的可靠性和说服力。 3. 完整且多层次的确证体系： 研究没有停留在组学筛选层面，而是对候选靶点进行了深入的功能验证，包括分子对接、SPR定量结合、体外酶活抑制、原位Pull-down以及共定位成像，构成了从计算到体外、再到细胞水平的完整证据链，论证非常扎实。 4. 探针设计的成功： 所设计的CQP探针在保留母药活性的前提下，成功引入了光交联和点击化学功能，是研究得以顺利开展的关键。
七、 其他有价值的内容 研究者在讨论中提到，他们发现的机制与一些早期现象（如氯喹对疟原虫滋养体期和裂殖体期杀伤力更强，而此阶段寄生虫糖消耗率显著升高）以及近期研究（如氯喹荧光衍生物可定位于线粒体等细胞器；转录组和代谢组学数据提示氯喹影响糖代谢相关基因）相吻合，这从不同侧面佐证了本研究发现的合理性。同时，作者也谨慎指出，本研究主要针对氯喹敏感株，未来需要考察这些新发现的靶点在氯喹耐药株中的作用变化。此外，文章披露的MS-CETSA数据中，也包含了传统已知的与氯喹作用相关的蛋白（如falcilysin、plasmepsin II/IV等），以及先前研究提示的多药耐药蛋白1（PfMDR1），这侧面反映了该方法的全面性，也暗示氯喹的作用可能是多靶点协同的。