本研究由Jeremy D. Grevet、Xianjiang Lan、Nicole Hamagami、Christopher R. Edwards、Laavanya Sankaranarayanan、Xinjun Ji、Saurabh K. Bhardwaj、Carolyne J. Face、David F. Posocco、Osheiza Abdulmalik、Cheryl A. Keller、Belinda Giardine、Simone Sidoli、Ben A. Garcia、Stella T. Chou、Stephen A. Liebhaber、Ross C. Hardison、Junwei Shi和Gerd A. Blobel共同完成。作者单位包括费城儿童医院血液科、宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院遗传学系、宾夕法尼亚州立大学生物化学与分子生物学系、宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院生物化学与生物物理学系以及宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院癌症生物学系。其中，Jeremy D. Grevet和Xianjiang Lan为并列第一作者，Junwei Shi和Gerd A. Blobel为共同通讯作者。这项研究于2018年7月20日发表在《Science》期刊上（第361卷，第6399期，第285-290页）。
这项研究的学术领域聚焦于血液学、遗传学和分子生物学，具体针对血红蛋白病的治疗靶点发现。研究背景在于，镰状细胞病和某些类型的β-地中海贫血等血红蛋白病是由成人型β-珠蛋白基因缺陷引起的。胎儿血红蛋白（HbF， fetal hemoglobin）在成人红细胞中的持续或重新表达可以显著改善这些患者的临床症状。目前，唯一获得FDA批准的提升HbF的药物羟基脲疗效有限，而基因疗法或基因编辑（如靶向BCL11A）虽前景广阔，但存在临床风险、成本和可及性限制。因此，寻找可药物化的小分子靶点以药理性地提升HbF水平，具有巨大的临床需求。先前研究已确定转录因子BCL11A和LRF是成人红细胞中γ-珠蛋白（HbF的珠蛋白组分）转录沉默的主要介导者，但转录因子本身难以用小分子药物靶向。相比之下，蛋白激酶被认为是更易被小分子调控的靶点类别。本研究旨在通过一种创新的筛选策略，发现调控HbF表达的可药物化蛋白激酶。
本研究的工作流程复杂而系统，主要包括以下几个步骤： 1. 优化CRISPR-Cas9筛选工具： 在进行大规模筛选前，研究团队首先优化了化脓链球菌Cas9的单向导RNA（sgRNA， single-guide RNA）支架，旨在提高基因编辑的靶向效率。他们开发并测试了多种sgRNA变体，最终确定了一个名为sgRNA2.1的优化版本。该版本在多个细胞系中表现出最高的基因编辑效率，在将sgRNA引入细胞后仅4天即可实现高达98%的编辑效率，为后续高通量筛选的可靠性和灵敏度奠定了基础。 2. 设计并执行激酶结构域聚焦的CRISPR-Cas9筛选： 研究团队设计了一个靶向482个人类激酶结构域的sgRNA文库（每个激酶结构域6个sgRNA，并包含50个非靶向sgRNA作为阴性对照）。该文库被克隆到优化的sgRNA2.1支架中。他们将此文库导入稳定表达Cas9的HUDEP2细胞（一种可诱导分化为类红细胞并主要表达成人血红蛋白的永生化人红系祖细胞系）中。随后，诱导细胞分化，并使用抗HbF的荧光激活细胞分选术（FACS， fluorescence-activated cell sorting）分离出HbF表达最高（前10%）和最低（后10%）的细胞群体。通过深度测序分析这两个群体中sgRNA的分布，来寻找在HbF高表达群体中富集的sgRNA，从而鉴定出可能作为HbF抑制因子的激酶。 3. 候选激酶的验证与功能表征： 筛选结果将血红素调节抑制剂HRI（又名EIF2AK1）鉴定为唯一的、所有靶向其的sgRNA均在HbF高表达群体中富集的激酶。随后，研究团队在HUDEP2细胞中分别表达了6个靶向HRI的“命中”sgRNA，并设置了靶向BCL11A的sgRNA（作为阳性对照）和非靶向sgRNA（作为阴性对照）。通过流式细胞术、蛋白质印迹（Western blot）等技术，验证了HRI敲低能显著增加HbF阳性细胞比例、降低HRI蛋白水平、减少其底物eIF2α的磷酸化，并特异性增加γ-珠蛋白蛋白水平，而不影响红系分化关键因子GATA1。 4. 多组学分析以探究HRI敲低的全局效应： 为了评估HRI敲低是否引起广泛的蛋白质组和转录组变化，研究团队对HRI敲低的HUDEP2细胞进行了全细胞质谱（质谱， mass spectrometry）分析和RNA测序（RNA-seq）。结果表明，在分化的HUDEP2细胞中，HRI敲低对整体蛋白质丰度和转录组分布的影响相对有限，而γ-珠蛋白在蛋白质和mRNA水平上都是最显著上调的分子之一，这提示HRI对γ-珠蛋白的调控具有高度特异性。 5. 在原代人类红系细胞和患者来源细胞中验证： 为了确认HRI在更生理相关的模型中的作用，研究团队在从健康供体和镰状细胞病（SCD， sickle cell disease）患者外周血CD34+造血干细胞分化而来的原代红系细胞中，使用短发夹RNA（shRNA， short hairpin RNA）敲低HRI。结果同样显示HbF蛋白和γ-珠蛋白mRNA水平显著升高。更重要的是，在SCD患者来源的细胞中，HRI敲低提升了HbF水平，并在低氧条件下减少了镰状细胞的形成，证明了其潜在的治疗相关性。 6. 机制探究： 为了阐明HRI调控HbF的分子机制，研究团队检测了已知的γ-珠蛋白直接转录抑制因子BCL11A和LRF的水平。蛋白质印迹显示，在原代红系细胞中，HRI敲低导致BCL11A蛋白水平大幅下降，而LRF水平不变。进一步分析发现，BCL11A的mRNA和初级转录本水平也显著降低，表明HRI主要通过抑制BCL11A的转录来发挥作用。多核糖体谱分析（Polysome profiling）表明，HRI敲低对BCL11A mRNA的翻译效率影响很小，进一步支持转录调控是主要机制。为了确认BCL11A下调在HRI敲低效应中的贡献，研究团队在HRI敲低的HUDEP2克隆细胞系中重新表达了BCL11A，结果成功地逆转了约65-80%的γ-珠蛋白去抑制，证明BCL11A是HRI下游的主要效应因子。 7. 联合治疗潜力的探索： 作为一种概念验证，研究测试了HRI敲低与已知的HbF诱导剂泊马度胺（Pomalidomide， 它可通过部分降低BCL11A转录来诱导HbF）的联合效果。在HUDEP2细胞中，HRI敲低与泊马度胺处理显示出最强的协同效应，能进一步提升HbF阳性细胞比例和γ-珠蛋白转录水平。
该研究取得了一系列明确的结果： 在激酶筛选中，HRI是唯一一个所有靶向sgRNA均在HbF高表达群体中一致富集的激酶，这强烈提示其作为HbF抑制因子的作用。在HUDEP2细胞中的验证实验证实，所有6个独立的HRI sgRNA均能有效增加HbF阳性细胞比例，并特异性上调γ-珠蛋白，同时降低eIF2α磷酸化水平。多组学数据（质谱和RNA-seq）的关键结果是，HRI敲低并未引起全局性的蛋白质组或转录组紊乱，而是高度特异性地诱导了γ-珠蛋白，这排除了其效应仅是细胞应激或翻译普遍失调的副产品的可能性。在原代细胞中的结果至关重要，它证明了HRI在生理相关的人类红系前体细胞中同样发挥HbF抑制功能，并且在SCD患者细胞中具有抗镰状细胞形成的效果，直接关联了其治疗潜力。机制研究的结果清晰地表明，HRI的缺失导致其下游靶点BCL11A在转录水平上显著下调，而BCL11A的重新表达可以大部分逆转HRI敲低引起的γ-珠蛋白升高，这建立了“HRI缺失 → BCL11A转录减少 → γ-珠蛋白去抑制（HbF升高）”的因果逻辑链条。联合治疗实验的结果则为进一步开发可能更有效的组合疗法提供了初步依据。
本研究的结论是：通过一种优化的、结构域聚焦的CRISPR-Cas9遗传筛选方法，在人类红系细胞中发现了一种红细胞特异性的激酶HRI，它是胎儿血红蛋白（HbF）的一个关键抑制因子。HRI主要通过调控转录因子BCL11A的表达来抑制γ-珠蛋白。靶向抑制HRI能够有效、特异地提升HbF水平，并在镰状细胞病模型细胞中减少镰状细胞形成，且对细胞活力和分化无明显不良影响。因此，HRI是一个有前景的、可用于治疗镰状细胞病和β-地中海贫血等血红蛋白病的新的可药物化靶点。
这项研究的科学价值和应用价值显著。在科学上，它揭示了一条此前未知的、由激酶HRI介导的调控胎儿血红蛋白表达的信号通路，丰富了我们对血红蛋白转换和红系细胞基因调控网络的理解。在应用上，它提出了一个全新的治疗靶点HRI。与难以用小分子靶向的转录因子BCL11A不同，HRI作为激酶，其活性口袋更易于设计小分子抑制剂。这为开发口服小分子药物来提升HbF提供了新的可能性，有望克服当前基因疗法和羟基脲的局限性。研究还暗示，将HRI抑制剂与其他HbF诱导剂（如泊马度胺）联用可能产生协同效应，优化治疗效果。
本研究的亮点在于：首先，重要的新发现：首次将HRI鉴定为成人红系细胞中HbF的关键调节因子，并阐明了其通过BCL11A发挥作用的机制。其次，方法学的创新：采用了“激酶结构域聚焦”的CRISPR筛选策略，并结合了经过优化的高活性sgRNA2.1支架，提高了筛选的效率和灵敏度，这种方法学上的改进对于未来类似的功能基因组学研究具有借鉴意义。第三，研究的系统性和严谨性：从全基因组筛选到候选基因验证，从细胞系模型到原代细胞和患者来源细胞验证，从表型观察到深入的机制探索（包括蛋白质组、转录组、多核糖体谱分析和拯救实验），构成了一个完整、闭合的证据链。第四，明确的转化医学前景：研究不仅在基础机制上有所突破，更始终指向治疗应用，最终提出了一个具有高度“可药物化”潜力的新靶点，并初步验证了其与现有药物的协同潜力，为后续的药物开发奠定了坚实的基础。
其他有价值的内容包括：研究指出，虽然此前有报道称通过药物Salubrinal稳定eIF2α磷酸化可以刺激HbF合成，但Salubrinal作用于HRI下游，其机制与本研究直接抑制HRI上游激酶活性的效果不同，且HRI敲低并未引起明显的细胞应激迹象。此外，研究提到HRI基因敲除小鼠在稳态下基本正常，这支持了靶向HRI可能具有良好安全性的观点，但也指出在应激条件下（如缺铁）HRI缺失的小鼠会出现适应不良，提示未来临床应用时需仔细评估其安全窗。这些信息为全面理解HRI靶点的生物学和潜在风险提供了重要背景。