本研究由Nan Zhou、Jingzhi Chen、Meiqin Hu等人完成，主要作者来自浙江大学第二附属医院与基础医学院的新基石科学实验室及良渚实验室，通讯作者为Meiqin Hu和Haoxing Xu。该研究于2025年6月26日发表在Cell杂志第188卷第3441至3458页，论文标题为“SLC7A11 is an unconventional H+ transporter in lysosomes”。
溶酶体是细胞内负责大分子降解的酸性细胞器，其内部pH需维持在4.5至5.0之间，才能为多种水解酶提供最适活性环境。溶酶体腔内的质子浓度梯度约为细胞质中的500倍，这种梯度依赖于V型ATP酶（V-ATPase）将质子泵入溶酶体腔。然而，溶酶体质子外流途径的分子机制长期以来并不完全清楚。此前的研究已经鉴定出TMEM175作为一种质子激活的质子选择性通道，构成快速质子泄漏通路，被称为LysoH1，主要在溶酶体过酸化时发挥作用。但当溶酶体pH处于4.5以上的轻度酸性范围或V-ATPase被抑制时，仍存在一种缓慢且持续的质子泄漏通路，其分子身份一直未被鉴定。本研究的目的即为寻找这一未知的缓慢质子泄漏通路，并阐明其在细胞生理及疾病中的作用。
研究者首先在野生型和TMEM175敲除细胞中证实，即使缺失LysoH1，巴弗洛霉素A1（bafilomycin-A1，Baf-A1）抑制V-ATPase后溶酶体仍会缓慢去酸化，说明存在TMEM175非依赖的质子泄漏通路，即LysoH2。为了寻找LysoH2的分子基础，研究团队构建了一个包含约60个孤儿溶酶体膜蛋白基因的CRISPR-Cas9敲除细胞文库，并利用比率型荧光探针进行溶酶体pH的定量筛选。筛选结果显示，在Baf-A1处理30分钟后，只有SLC7A11敲除细胞的溶酶体仍保持显著酸化，提示SLC7A11是LysoH2的必要分子。同时，研究团队还利用高通量药物筛选，发现SLC7A11的抑制剂erastin能够增强溶酶体酸性染料LysoTracker的信号，即导致溶酶体过酸化，而多种已知的溶酶体碱化剂则引起去酸化。这两方面的筛选结果共同将SLC7A11确定为溶酶体缓慢质子泄漏通路的候选分子。
为验证SLC7A11的功能，研究者在HT1080细胞中系统比较了野生型和SLC7A11敲除细胞对Baf-A1的响应。野生型细胞中，Baf-A1以剂量和时间依赖方式引起溶酶体去酸化，EC50为19纳米，时间常数为6.7分钟。而SLC7A11敲除细胞的溶酶体不仅基础酸性更强，而且在高达1000纳米的Baf-A1处理下仍保持酸化。多种SLC7A11抑制剂如erastin、sulfasalazine和imidazole ketone erastin均能模拟敲除表型，在野生型细胞中阻止Baf-A1诱导的去酸化，但在SLC7A11敲除细胞中无进一步作用。这些结果在多种细胞类型中均得到重复，说明SLC7A11介导的溶酶体质子泄漏具有广泛性。通过比率型化学探针和遗传编码的pHlare探针进行精细pH校准，研究者发现SLC7A11敲除细胞的溶酶体基础pH比野生型低约0.4个pH单位，并且SLC7A11介导的质子泄漏速率估算为每秒100至1000个质子，约为V-ATPase泵速相近，但比TMEM175通道最大激活速率慢约10倍。
在亚细胞定位方面，研究团队通过免疫分离溶酶体、荧光共定位、超分辨显微镜及免疫电镜等多种手段证实，SLC7A11及其伴侣蛋白SLC3A2主要定位于溶酶体膜而非以往认为的质膜。他们进一步通过突变分析鉴定出三联位点突变体SLC7A11AAS，该突变体显著降低溶酶体定位但保留质膜表达，为区分SLC7A11在溶酶体与质膜中的功能差异提供了遗传工具。
关于SLC7A11介导质子泄漏的分子机制，研究团队提出其并非直接运输质子，而是通过胱氨酸和谷氨酸这两种可滴定的质子等价物进行间接质子转运。溶酶体腔内的胱氨酸浓度约为细胞质中的30倍，而细胞质中的谷氨酸浓度约为溶酶体腔内的10倍。SLC7A11作为胱氨酸/谷氨酸反向转运体，驱动胱氨酸外流和谷氨酸内流。由于谷氨酸的侧链羧基pKa约为4.3，在溶酶体酸性环境中可结合质子，因此谷氨酸内流可消耗溶酶体腔内的质子，导致去酸化；而胱氨酸具有一个pKa约为7.5的氨基，在细胞质和溶酶体之间的pH环境下也可作为质子载体。为验证这一假说，研究者在分离的溶酶体上直接施加细胞质侧谷氨酸，发现只有当SLC7A11功能完整时，谷氨酸才能引起溶酶体去酸化。药物抑制SLC7A11或基因敲除均能阻断该效应。胱氨酸甲基酯加载提高腔内胱氨酸浓度，也能促进质子泄漏。这些实验支持了“底物作为质子穿梭体”的机制模型。
功能层面，SLC7A11缺失或抑制导致溶酶体过酸化，进一步损害了溶酶体的降解功能。研究发现，SLC7A11敲除细胞和组织中出现了溶酶体贮积表型，包括胆固醇和脂褐素蓄积以及溶酶体异常增大。组织蛋白酶B的活性在SLC7A11敲除细胞中显著下降，但通过1微摩尔氯喹（chloroquine，CQ）将溶酶体pH恢复至正常范围后，酶活性和降解功能均得到恢复。这表明SLC7A11介导的溶酶体质子泄漏对维持最适降解酸性环境至关重要。
研究者还深入探讨了溶酶体pH稳态与铁死亡的关系。铁死亡是一种铁依赖的脂质过氧化驱动的细胞死亡形式，SLC7A11是铁死亡的关键调控因子。本研究发现，erastin引起的SLC7A11依赖的铁死亡可被低浓度CQ抑制，且这种保护效应呈现钟形浓度依赖，说明溶酶体pH恢复到最适范围是抗铁死亡的关键。相反，RSL3诱导的铁死亡不受CQ影响。在SLC7A11敲除细胞中，自发性铁死亡可通过CQ处理或过表达TMEM175来抑制，但过表达孔道功能缺失的TMEM175突变体无此保护效果。值得注意的是，溶酶体pH归一化虽不能恢复细胞内谷胱甘肽水平，但能显著抑制脂质过氧化，从而阻断铁死亡的最终执行步骤。这些结果表明，溶酶体质子泄漏为SLC7A11抗铁死亡功能所必需。
在帕金森病（Parkinson’s disease，PD）相关病理方面，研究团队从早发型PD患者中发现了多个罕见的SLC7A11错义突变，如V76M、E31G、G333R等，这些突变均损害了SLC7A11调控溶酶体pH和降解的功能。利用携带V76M突变的患者来源细胞进行重编程并分化为诱导神经元和多巴胺能神经元，研究者发现这些细胞表现出溶酶体过酸化和降解缺陷，且对预成形的α-突触核蛋白纤维的聚集更为敏感。CQ处理可减轻这些病理表型。在SLC7A11敲除小鼠中，脑内注射预成形α-突触核蛋白纤维后，皮层和纹状体中磷酸化α-突触核蛋白聚集显著增加，并伴随运动功能障碍。这些结果提示，SLC7A11介导的溶酶体质子泄漏在PD等神经退行性疾病的病理过程中具有保护作用。
本研究的亮点在于首次鉴定SLC7A11为溶酶体缓慢质子泄漏通路LysoH2的分子基础，并阐明了其通过胱氨酸和谷氨酸通量实现质子等价物转运的非经典机制。该工作将溶酶体氨基酸代谢与pH稳态、降解功能、铁死亡及神经退行性疾病病理联系起来，为调节溶酶体酸度作为治疗策略提供了概念验证。此外，研究建立了从孤儿溶酶体膜蛋白筛选到体内疾病模型验证的系统性研究流程，为未来溶酶体离子稳态研究提供了范例。