本报告旨在向国内科研同行介绍由Galina Dvoriantchikova、Steve Pappas、Xueting Luo、Marcio Ribeiro、Dagmara Danek、Daniel Pelaez、Kevin K. Park及Dmitry Ivanov*等学者合作完成的一项原创性研究。该研究发表于《European Journal of Neuroscience》2016年12月刊（第44卷，第11期，页2935-2943）。研究团队主要来自美国迈阿密大学米勒医学院的Bascom Palmer眼科研究所和迈阿密瘫痪治疗项目组。
本研究聚焦于神经科学和眼科学交叉领域，具体关注视网膜神经节细胞（Retinal Ganglion Cells, RGCs）在损伤后的存活与轴突再生难题。RGCs是将视觉信息从视网膜传递至大脑视觉皮层的关键神经元，其死亡或轴突损伤是青光眼、糖尿病视网膜病变、缺血性视神经病变等多种致盲性眼病的共同病理基础。目前，尚无有效技术能够再生已损失的RGCs，因此，开发旨在保护受损RGCs存活并促进其轴突再生的疗法具有迫切的临床需求。尽管已有多种策略被探索，但RGCs的存活率和轴突再生程度仍非常有限。
研究的理论基础在于核因子κB（Nuclear Factor kappa B, NFκB）信号通路。大量证据表明，NFκB信号在许多类型的神经元中扮演着关键的促生存角色，并能调节神经突生长。NFκB转录因子通常由p65（RelA）和p50（NFκB1）亚基组成异二聚体，其活性，特别是p65亚基的磷酸化状态，对于其转录激活至关重要。然而，先前研究发现，尽管RGCs中存在p65和p50亚基，但在神经毒性条件下（如缺血或视神经损伤），p65处于非磷酸化的失活状态，且这种NFκB信号激活的缺失与RGCs死亡增加相关。因此，研究团队提出科学假设：在RGCs中特异性增强NFκB信号，可能成为一种有效的治疗策略，用以保护RGCs免受损伤导致的死亡，并可能促进轴突再生。本研究的目标即是通过基因治疗手段，将一种组成型激活（模拟磷酸化）的p65突变体（p65mut）特异性递送至RGCs，评估其在视网膜缺血和视神经挤压（Optic Nerve Crush, ONC）两种动物模型中，对RGCs存活和轴突再生的影响。
本研究的工作流程系统而严谨，涵盖了分子构建、病毒包装、体外验证、体内递送、疾病模型建立、表型评估及统计分析等多个环节。
首先，研究人员进行了分子构建与病毒制备。他们采用“磷酸化模拟”策略，合成了编码激活态p65的DNA序列。具体而言，他们对p65蛋白的两个关键丝氨酸位点进行了定点突变：将第276位丝氨酸替换为天冬氨酸（S276D），以模拟磷酸化，实现组成型激活；同时将第536位丝氨酸替换为丙氨酸（S536A），以防止可能发生的该位点磷酸化（此前研究提示该位点磷酸化在某些神经元中会抑制神经突生长）。由此构建了p65 S276D/S536A双突变体（p65mut）。随后，他们将此突变体cDNA克隆入包含腺相关病毒血清型2（Adeno-Associated Virus Serotype 2, AAV2）反向末端重复序列的质粒中。AAV2因其对RGCs的高效且特异性转导能力而被选为基因递送载体。最终，通过迈阿密大学病毒载体核心设施，制备了高滴度（1×10^13 基因组拷贝/毫升）的AAV2-p65mut病毒颗粒，同时制备了表达绿色荧光蛋白（GFP）的AAV2-GFP作为对照病毒。
其次，研究进行了体外验证。为了确认突变蛋白的表达与稳定性，他们用AAV2-p65mut质粒转染AAV-293细胞，并通过免疫细胞化学和蛋白质印迹（Western Blot）进行分析。结果表明，p65mut在细胞中高效表达，且主要定位于细胞核，证实了基因修饰未影响蛋白的表达与稳定性。同时，他们分离了原代RGCs进行培养，并用AAV2-p65mut病毒颗粒进行体外转导，免疫染色再次证实p65mut能在RGCs中高效表达并核定位。
第三，体内递送与特异性验证。研究人员通过玻璃体腔注射方式，将AAV2-p65mut或对照病毒（AAV2-MCS，即“空”载体）注射到成年C57BL/6小鼠的眼内。注射两周后，取视网膜进行免疫组化分析。使用RGCs标记物βIII微管蛋白（Tubb3）和p65抗体共染色，结果清晰地显示，p65mut的表达严格限定于Tubb3阳性的RGCs中，并且主要位于细胞核内，而对照组视网膜中未检测到异常的p65高表达。这证实了AAV2能够高效、特异地将目的基因递送至成年动物视网膜的RGCs。
第四，建立疾病模型与治疗评估。本研究使用了两种经典的RGC损伤模型来模拟不同的细胞死亡机制：短暂性视网膜缺血模型（主要诱导RGCs发生程序性坏死，necroptosis）和视神经挤压模型（主要诱导RGCs发生凋亡，apoptosis）。动物分组为实验组（注射AAV2-p65mut）和对照组（注射AAV2-GFP）。在病毒注射至少两周后，对小鼠实施损伤手术。对于缺血模型，通过升高眼内压诱导视网膜缺血45分钟，再灌注7天后处死动物取材。对于视神经挤压模型，用精细镊子挤压视神经，两周后取材。每个实验组和对照组均包含5只小鼠（样本量通过功效分析预先确定，以检测20%的生存率差异，统计效能80%，显著性水平5%）。
第五，表型分析。RGCs存活率是核心评估指标。研究人员取视网膜进行铺片，用Tubb3抗体染色标记存活的RGCs，并通过共聚焦显微镜成像。在每个视网膜的四个象限随机采集20张图像，使用ImageJ软件计数Tubb3阳性细胞。RGCs存活率以同只动物未手术对照眼（对侧眼）的平均细胞密度为基准进行百分比计算。轴突再生能力则在视神经挤压模型中评估。在处死动物前2天，向玻璃体腔注射霍乱毒素B亚单位Alexa 555偶联物（CTB-555）进行顺行示踪。取视神经制作冰冻切片，在损伤点远端500微米处计数CTB标记的再生轴突数量，每只动物至少分析4个切片。
第六，数据分析。研究采用学生t检验进行组间比较，p值≤0.05被认为具有统计学显著性。
本研究取得了明确而细致的结果。
在蛋白表达验证方面，体外实验成功证实了p65mut的高效表达与核定位，为后续功能研究奠定了基础。
在RGCs特异性递送方面，体内实验完美展示了AAV2载体系统的靶向性，为精准治疗提供了技术保障，也避免了NFκB信号在胶质细胞中可能产生的促炎副作用。
在神经保护效果方面，结果呈现出模型依赖性。在视神经挤压（凋亡模型）中，AAV2-p65mut治疗显示了极其显著的促存活作用。实验组RGCs存活率高达77±7%，而对照组仅为25±3%，差异具有高度统计学意义（p=0.0001）。这表明，组成型激活的p65mut能非常有效地抑制损伤诱导的RGCs凋亡。然而，在短暂性视网膜缺血（程序性坏死模型）中，虽然实验组RGCs存活率（55±12%）在数值上高于对照组（35±6%），但该差异未达到统计学显著性（p=0.14）。这提示，增强的NFκB信号对RGCs程序性坏死的抑制作用可能相对较弱，或者需要不同的调控机制。
在轴突再生方面，结果令人失望。尽管在视神经挤压模型中p65mut显著提升了RGCs的存活率，但对轴突再生却无促进作用。对CTB标记的再生轴突进行定量分析显示，实验组（平均3.91±0.96根）与对照组（平均2.83±0.93根）之间没有显著差异（p=0.45）。这与形态学观察相符：许多存活的、表达p65mut的RGCs胞体萎缩，轴突杂乱无序，呈现出不健康的形态，说明细胞稳态未能恢复正常。
这些结果之间具有清晰的逻辑关系。首先，AAV2载体的成功构建和靶向验证是进行后续功能研究的前提。其次，在两种模型中得到的不同保护效率，揭示了NFκB-p65信号对RGCs不同死亡通路（凋亡 vs. 程序性坏死）的干预效力存在差异。最后，存活率提升但轴突再生无改善、细胞形态异常的结果，共同指向一个核心结论：单纯模拟p65第276位丝氨酸的磷酸化（激活），虽然足以提供显著的生存信号（尤其针对凋亡），但不足以启动或支持复杂的轴突再生程序，也无法恢复细胞的完全健康状态。这些结果直接支撑了研究的最终结论。
本研究的结论是：通过AAV2载体在RGCs中特异性递送组成型激活的NFκB p65突变体（p65mut），能够有效增强NFκB信号，从而显著提高损伤后RGCs的存活率，特别是在以凋亡为主的视神经损伤模型中效果突出。然而，这种单一的p65修饰（S276D/S536A）虽然具有神经保护作用，但不足以促进轴突再生，也无法使受损的RGCs恢复正常的细胞稳态。
该研究具有重要的科学价值和应用价值。在科学上，它深化了我们对NFκB信号在特定神经元类型（RGCs）中功能特异性的理解，揭示了相同的信号通路在不同细胞死亡情境下（凋亡与坏死）可能发挥不同强度的保护作用。更重要的是，它明确指出了“神经元存活”与“轴突再生”是两个可分离的生物学过程，需要不同的分子信号组合来协同驱动。这为未来开发组合疗法（如联合其他促再生因子）提供了理论基础。在应用上，研究验证了AAV2介导的基因疗法靶向RGCs的可行性，并证实了调控内源性信号通路（如NFκB）作为神经保护策略的潜力，为治疗青光眼等RGC变性眼病提供了新的潜在治疗靶点和递送策略。
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：第一，研究发现的创新性：清晰揭示了在成年RGCs中，增强NFκB信号可强力促生存但不足以促再生的“悖论”现象，强调了修复过程中存活与再生信号的差异性。第二，研究方法的精准性：创新性地采用“磷酸化模拟”策略构建组成型活性p65，并结合高度特异性的AAV2-RGCs递送系统，实现了对目标细胞类型内特定信号通路的精准操控，避免了在胶质细胞中激活NFκB可能带来的副作用，实验设计严谨。第三，疾病模型的互补性：同时采用凋亡和程序性坏死两种不同主导死亡机制的损伤模型，全面评估了干预策略在不同病理条件下的效果，使结论更为全面和可靠。第四，结论的启发性：研究结果明确指出，未来的神经修复疗法需要多靶点组合策略，在促进存活的同时，必须激活独立的轴突再生程序，这为后续研究指明了方向。
此外，研究在讨论部分还提供了有价值的延伸思考。例如，作者分析了NFκB信号双重性（促生存 vs. 促炎症）可能取决于不同的p65磷酸化位点组合及细胞类型特异性共因子。他们也推测，除了S276位点，可能还需要对p65进行其他修饰，或引入其他转录因子/共因子，才能完全恢复RGCs的稳态并驱动轴突再生。这些观点为进一步探索RGCs再生的分子机制提供了丰富的线索。