本研究由Jianfei Zhang、Heng Yu和Menghan Mao作为共同第一作者，通讯作者为Yuan Tian（上海交通大学医学院附属第九人民医院）和Junyan Wang（中国科学院杭州医学研究所），发表于*ACS Chemical Biology*，2025年11月6日。研究团队构建了一种环状核酸适配体-反义寡核苷酸嵌合体（circular aptamer-antisense oligonucleotide chimera，circApt-ASO），通过靶向沉默信号转导及转录激活因子5A（signal transducer and activator of transcription 5A，STAT5A）来激活远端缺失同源盒基因5（distal-less homeobox 5，DLX5）调控的成骨分化，从而促进骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）的骨再生。
在学术背景方面，骨科临床中约5%至10%的长骨骨折可能发生延迟愈合或不愈合，标准治疗包括手术植骨和生长因子治疗。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）曾是最广泛使用的非植骨疗法，但由于其缺乏对间充质干细胞的靶向特异性，可导致软组织肿胀、异位成骨甚至肿瘤发生等严重副作用。因此，开发更安全有效的替代策略成为重要方向。DLX5是成骨分化早期的关键转录因子，其下游调控Runt相关转录因子2（RUNX2）和Osterix（OSX），进而上调碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和骨钙素（osteocalcin，OCN）等骨特异性基因。STAT5A是DLX5的直接负调控因子，STAT5A缺失可显著促进成骨分化并加速骨折愈合。基于此，本研究旨在利用特异性靶向BMSCs的核酸适配体递送系统，实现对STAT5A的温和且高效沉默，并激活DLX5信号通路。
研究流程首先对适配体载体进行筛选。实验比较了多种核酸适配体对人骨髓间充质干细胞（human BMSCs，hBMSCs）的结合能力，结果显示靶向转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1，TFR1）的适配体（AptTFR）对hBMSCs具有高亲和力和选择性，且TFR1在hBMSCs中的mRNA和表面蛋白水平显著高于其他非致瘤细胞系，因此被选为载体模块。随后构建circApt-ASO，其包含AptTFR模块、靶向STAT5A的反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）模块和用于降低空间位阻的连接子模块。线性嵌合体经5′磷酸化后，通过T4 DNA连接酶与夹板链（splint）进行环化，再用核酸外切酶I和III消化未环化前体和夹板链，从而富集共价闭合的环状产物。实验同时合成了硫代磷酸酯修饰的线性嵌合体（PS-SApt-ASO）和非修饰线性嵌合体（SApt-ASO）作为对照。血清稳定性实验显示，在含20%胎牛血清的培养基中，circApt-ASO在24小时后仍保持完整，而PS修饰和非修饰线性嵌合体均快速降解，证实环化策略优于传统化学修饰。
在结合、内吞与胞内命运方面，流式细胞术测定circApt-ASO与hBMSCs的解离常数（Kd）为7.2±0.9 nM，与SApt-ASO的7.4±0.9 nM相当，而PS-SApt-ASO因非特异性结合表现出略高的亲和力（Kd为4.6±1.9 nM）。将AptTFR环区替换为poly dT的circAptmut-ASO几乎失去结合能力，证明AptTFR模块介导了嵌合体与细胞的结合。内吞实验表明，circApt-ASO在孵育2小时内胞内荧光缓慢增加，12小时出现6.4倍的快速上升，24小时趋于饱和。共聚焦分析显示circApt-ASO与早期内体标记RAB5B和循环内体标记RAB11A强共定位，而与晚期内体标记RAB7A和溶酶体标记LAMP1共定位极弱，说明嵌合体主要通过早期内体-循环内体途径运输，避免了溶酶体降解。
STAT5A沉默实验显示，circApt-ASO在100–200 nM范围内呈剂量依赖性降低STAT5A蛋白水平，200 nM时达到约57%的敲低效率，48小时达到最大效应并在72小时仍维持51%的沉默水平。PS-SApt-ASO的最大敲低效率仅为35%，并在72小时后恢复到基线的91%；SApt-ASO仅有微弱效果。共聚焦观察证实circApt-ASO处理后细胞质STAT5A荧光强度显著下降。与脂质体转染相比，circApt-ASO的敲低效率低约10%，但细胞增殖实验显示脂质体显著抑制增殖，而circApt-ASO无明显细胞毒性，表明该平台对脆弱的BMSCs更加温和。
成骨诱导实验进一步验证了功能。circApt-ASO处理4天后，DLX5的mRNA和蛋白水平随剂量升高而显著增加，其下游RUNX2、OSX、ALP和OCN也呈现类似上调趋势。200 nM时DLX5及其下游基因表达、ALP活性和茜素红染色矿化程度均达到最大。PS-SApt-ASO仅引起中等程度的ALP活性和矿化增加，而SApt-ASO几乎无成骨诱导效应。免疫荧光染色还显示DLX5和STAT5A蛋白表达呈负相关。这些结果表明circApt-ASO通过抑制STAT5A有效激活了DLX5调控的成骨基因网络，并促进hBMSCs的成骨分化。
本研究的结论是，circApt-ASO平台能实现对hBMSCs的高效、靶向、低毒性的核酸药物递送，通过持续沉默STAT5A而强烈激活DLX5调控的成骨分化。这项策略为延迟愈合和不愈合骨折等成骨分化受损疾病提供了新的治疗思路。研究还讨论了局限性，包括TFR1在其他组织的表达可能带来脱靶风险，以及STAT5A参与免疫调节和细胞增殖的潜在多效性影响，并提出局部支架递送和转录组分析等后续转化方向。
本研究的亮点包括：采用环化策略而非化学修饰来提升寡核苷酸的生物稳定性；利用AptTFR实现受体介导的细胞内吞和溶酶体逃逸；以及用低细胞毒性的方法实现对STAT5A的持续沉默并促进成骨。与传统BMPs疗法相比，该平台具有更高的靶向性和安全性，展示了核酸适配体-ASO嵌合体在骨再生治疗中的价值。