本研究由美国农业部农业研究局（USDA-ARS）的Bret Cooper与Ronghui Yang合作完成，发表于2024年的《Scientific Reports》期刊，标题为《An assessment of AcquireX and Compound Discoverer software 3.3 for non‑targeted metabolomics》。研究聚焦于非靶向代谢组学（non-targeted metabolomics）领域，旨在评估Thermo Scientific Orbitrap Exploris 240质谱仪配套的AcquireX和Compound Discoverer 3.3（CD3.3）软件在酵母代谢物鉴定中的性能与局限性。

学术背景

代谢组学作为后基因组时代的重要研究工具，通过分析小分子代谢物（small molecules）的动态变化揭示生物系统的功能状态。然而，与基因组学和蛋白质组学相比，代谢组学缺乏标准化的准确性评估指标，且代谢物的结构多样性和动态范围使其鉴定面临挑战。本研究以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY4741菌株为模型，通过高分辨率质谱技术结合软件分析，探索提高化合物检测数量和鉴定准确性的方法。研究目标包括：（1）评估AcquireX软件通过多轮MS2采集提升可鉴定化合物数量的能力；（2）验证CD3.3软件基于MS2谱库匹配的化合物鉴定准确性；（3）揭示软件分析中潜在的误差来源及其对研究结论的影响。

研究流程

1. 酵母代谢物提取

研究采用极性（甲醇/水）和非极性（氯仿/甲醇）溶剂分步提取酵母代谢物。样本包括6个生物学重复的酵母培养物和2个基质空白对照。细胞破碎使用珠磨法（bead mill），提取液经真空干燥后复溶于特定溶剂，用于后续质谱分析。

2. 质谱数据采集

使用Orbitrap Exploris 240质谱仪，分别在正离子和负离子模式下采集数据。关键创新点在于AcquireX软件的迭代MS2采集策略：
- 离子排除列表生成：通过基质空白样本建立背景离子排除列表。
- 离子纳入列表优化：利用QC样本（pooled biological samples）生成目标离子列表。
- 六轮MS2采集：每轮采集后，已分析的离子自动加入排除列表，后续轮次聚焦于低丰度离子。质谱参数包括：分辨率120,000（MS1）和30,000（MS2），质量精度 ppm，动态排除窗口1.0 Da。

3. 数据分析流程

CD3.3软件处理流程包括：
- 色谱对齐与峰检测：采用2 ppm质量容差和0.25分钟保留时间（retention time, RT）容差。
- 背景过滤与标准化：使用SERRF算法（QC-based normalization）和空白样本过滤背景信号。
- 化合物鉴定：比对NIST_2020_MSMS、mzCloud及自定义氨基酸标准库（20种氨基酸），匹配阈值设定为70分（满分100）。
- 人工验证：针对高分匹配化合物检查母离子质量偏差、RT一致性及碎片离子合理性。

主要结果

1. AcquireX提升检测深度：六轮MS2采集使可鉴定化合物数量增加50%，其中前两轮贡献84%的MS2谱图，后四轮主要捕获低丰度离子（图2）。
   
2. 化合物鉴定数量与误差：
   
   • 极性组分在负离子模式下检测到更多MS1离子（23,843个），但正离子模式鉴定出更多高置信度化合物（图3a）。
     
   • 最终非冗余鉴定结果为483种化合物，包括17种酵母内源氨基酸。
     
3. 软件局限性案例：
   
   • 错误匹配：例如，母离子m/z 156.0768的MS2谱匹配到质量偏差113 Da的乙酰肌肽（acetylcarnosine）（图6a），实际应为组氨酸（histidine）。
     
   • 同分异构体混淆：亮氨酸（leucine）和异亮氨酸（isoleucine）因RT接近被合并为一个峰（图8a）。
     
   • 离子变体干扰：丝氨酸（serine）因[m+ACN+H]+离子信号过强被标准化过滤（图9a）。
     

结论与意义

本研究证实AcquireX能有效扩展代谢物检测覆盖度，但CD3.3的鉴定结果需结合人工验证以规避以下问题：（1）谱库匹配分数与真实准确性不完全一致；（2）同分异构体和共洗脱化合物难以区分；（3）离子变体（如加合物）可能导致假阴性。科学价值在于为代谢组学研究提供了软件使用的最佳实践框架，强调多维度验证的必要性。应用价值体现在为医学、环境科学和农业领域的代谢组学平台选择与数据分析提供基准参考。

研究亮点

1. 方法学创新：首次系统评估AcquireX多轮MS2采集策略对代谢物检测效率的提升。
   
2. 误差系统性分析：揭示软件算法在母离子匹配、RT对齐及谱库搜索中的潜在误差机制。
   
3. 跨领域适用性：研究结论可推广至其他采用高分辨率质谱的非靶向代谢组学场景。
   

其他价值

数据已公开于MassIVE（MSV000092514），支持后续研究复用。作者建议未来开发集成化工具以自动估算假阳性率（false discovery rate, FDR），并呼吁代谢组学社区建立更完备的参考谱库。