学术研究报告：Secretagogin下调通过抑制LEF-1/NCAM1轴损害先天性巨结肠（Hirschsprung disease, HSCR）中的神经细胞迁移

一、研究团队与发表信息

本研究由华中科技大学同济医学院附属协和医院小儿外科的Yun Zhou、Shuiqing Chi、Shuai Li等共同完成，通讯作者为Shao-Tao Tang（邮箱：tshaotao83@hust.edu.cn）。研究成果于2025年发表在Molecular & Cellular Proteomics（*Mol Cell Proteomics*）期刊第24卷第8期，文章编号101032，开放获取（CC BY 4.0许可）。

二、学术背景

研究领域：本研究属于发育神经生物学与小儿外科的交叉领域，聚焦于先天性巨结肠（HSCR）的发病机制。HSCR是一种常见的肠道神经系统（Enteric Nervous System, ENS）发育障碍，发病率约为1-2.⁶⁄₁₀,000新生儿，特征为远端肠道神经节细胞缺失，导致功能性肠梗阻。目前认为，HSCR的核心病因是迷走神经嵴细胞（vagal neural crest cells）在胚胎期的迁移受阻，但具体分子机制尚未完全阐明。

研究动机：Secretagogin（SCGN）是一种EF-hand结构钙结合蛋白，既往研究提示其在中枢神经系统再生中通过调控基质金属蛋白酶（MMP-2）促进神经元迁移，但其在ENS发育中的作用未知。本研究通过蛋白质组学筛选发现SCGN在HSCR病变结肠组织中显著下调，进而探索其功能机制及临床诊断潜力。

研究目标：
1. 验证SCGN在HSCR患者组织中的表达特征；
2. 阐明SCGN缺失如何通过分子通路（如LEF-1/NCAM1轴）影响神经嵴细胞迁移；
3. 评估SCGN作为HSCR诊断标志物的临床价值。

三、研究流程与方法

1. 样本收集与蛋白质组学分析

• 样本来源：
  
  • HSCR组：3例手术切除的HSCR患儿病变结肠组织（狭窄段、过渡段、扩张段）；
    
  • 对照组：3例腹部外伤患者的正常结肠组织。
    
• 技术方法：
  
  • TMT（Tandem Mass Tag）标记定量蛋白质组学：鉴定差异表达蛋白（阈值：Fold Change >1.2，p<0.05），共发现162个差异蛋白（77个上调，85个下调），SCGN为第三显著下调蛋白。
    
  • 验证实验：Western blot（WB）和免疫组化（IHC）在10例独立样本（5例HSCR vs. 5例非HSCR）中确认SCGN低表达与神经节细胞缺失的相关性。
    

2. 细胞功能实验

• 细胞模型：人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y和SK-N-BE(2)，模拟肠道神经嵴细胞迁移。
  
• 实验设计：
  
  • 过表达与敲低：通过质粒转染和siRNA沉默SCGN表达；
    
  • 功能检测：
    
  • Transwell迁移实验：SCGN过表达使迁移细胞数增加2.5倍（p<0.001）；
    
  • 划痕愈合实验：SCGN敲低显著延缓愈合速率（48小时愈合率下降40%）；
    
  • CCK-8增殖实验：SCGN对细胞增殖无影响（p>0.05）。
    

3. 动物模型验证

• 斑马鱼胚胎实验：
  
  • 基因敲降：设计两种靶向scgn的Morpholino（MO1/MO2），注射至单细胞期胚胎；
    
  • 表型分析：
    
  • 原位杂交：SCGN缺失导致脊髓神经长度缩短30%（p<0.001）；
    
  • 免疫荧光：神经元标志物HuC/D染色显示神经发育缺陷，可通过外源SCGN mRNA部分挽救。
    

4. 分子机制解析

• 通路富集分析：KEGG显示细胞黏附分子（Cell Adhesion Molecules）通路最显著富集，NCAM1（Neural Cell Adhesion Molecule 1）为关键下游分子。
  
• 调控机制验证：
  
  • 双荧光素酶报告实验：转录因子LEF-1直接结合NCAM1启动子（结合位点预测通过JASPAR数据库），激活其转录（荧光活性提升3倍，p<0.001）；
    
  • 救援实验：SCGN敲低导致LEF-1和NCAM1表达下降，而过表达LEF-1可逆转NCAM1下调及迁移抑制。
    

5. 临床诊断价值评估

• 黏膜活检分析：130例便秘儿童（52例HSCR vs. 78例非HSCR）的术前活检标本中，SCGN免疫组化诊断灵敏度达100%，特异性98.72%。
  
• 内参优化：杯状细胞（goblet cells）的SCGN阳性染色可作为内控，减少假阳性。
  

四、主要研究结果

1. SCGN表达特征：HSCR病变结肠中SCGN表达显著低于对照组（WB灰度值下降60%，p<0.001），且与神经节细胞数量正相关。
   
2. 功能表型：SCGN通过LEF-1/NCAM1轴促进神经嵴细胞迁移，但不影响增殖。
   
3. 动物模型：斑马鱼SCGN敲降导致脊髓神经发育缺陷，表型可被外源SCGN部分挽救。
   
4. 诊断价值：SCGN免疫组化在黏膜活检中展现出极高的诊断准确性，优于现有标志物（如calretinin）。
   

五、研究结论与意义

科学价值：
- 首次揭示SCGN-LEF-1-NCAM1轴在HSCR发病中的作用，填补了ENS迁移调控机制的空白；
- 提出SCGN可作为HSCR的新型分子标志物，为早期诊断提供新工具。

应用价值：
- SCGN免疫组化可简化HSCR术前诊断流程，减少误诊率（如避免calretinin的假阳性问题）；
- 靶向SCGN通路的药物开发可能成为未来治疗方向。

六、研究亮点

1. 多组学整合：结合TMT蛋白质组学、细胞/动物模型及临床样本验证，形成完整证据链。
   
2. 机制创新：发现SCGN通过转录调控（非直接钙信号）影响NCAM1表达的新模式。
   
3. 临床转化：SCGN诊断方案具有高敏感性和特异性，已通过大样本队列验证。
   

七、其他有价值内容

• 局限性：未系统比较SCGN与其他标志物（如peripherin）的诊断效能，且SCGN上游调控机制（如TNFα/NF-κB通路）需进一步验证。
  
• 数据公开：质谱原始数据已上传至iProX数据库（编号PXD058158）。
  

（全文约2000字）