本研究由Soll Jin, Jae-Goo Kim, Hye Jin Kim, Ji Young Kim, Sang Hoon Kim, Hee Cheol Kang, 以及 Mi Jung Kim共同完成，第一作者及主要合作者隶属于GFC Life Science Co., Ltd.（韩国华城）的人类与微生物组通讯实验室，通讯作者为Hee Cheol Kang和Mi Jung Kim。Sang Hoon Kim则来自韩国庆熙大学生物学系。这项研究成果以题为《miRNA408 from Camellia japonica L. Mediates Cross-Kingdom Regulation in Human Skin Recovery》的论文形式，于2025年8月1日在学术期刊《Biomolecules》（2025年第15卷，文章编号1108）上正式发表。
本研究的学术背景聚焦于植物来源的生物活性成分在皮肤治疗和再生医学中的应用潜力，特别是新兴的植物源性细胞外囊泡（Plant-derived Extracellular Vesicles, EVs）领域。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是细胞分泌的纳米级（通常50-200 nm）脂质双层结构，包含蛋白质、脂质、微小RNA（microRNA, miRNA）等多种生物活性分子，在介导细胞间通讯中扮演关键角色。近年来，动物来源的EVs（如外泌体）已被广泛研究，而植物来源的囊泡（Plant-derived Vesicles, PDVs）因其生物相容性、低毒性及丰富的生物活性，在治疗和化妆品开发中展现出巨大潜力。另一方面，miRNA是一类短链非编码RNA，通过在转录后水平调控信使RNA（mRNA）的稳定性或翻译效率来精细调节基因表达。植物miRNA不仅对植物自身的生长发育和逆境响应至关重要，更有研究发现，它们可以通过饮食摄入等方式进入哺乳动物体内，发挥跨物种（Cross-Kingdom）的基因调控作用，这为利用植物miRNA开发新型疗法开辟了全新思路。在此背景下，研究团队选择了山茶花（Camellia japonica L.），一种在化妆品领域因其卓越保湿和滋养特性而备受推崇的植物，作为研究对象。然而，关于山茶花来源的EVs及其携带的miRNA对人类皮肤细胞的具体作用及其分子机制，此前研究甚少。因此，本研究旨在填补这一空白，具体目标为：从山茶花愈伤组织（callus）中分离纯化EVs（CJ-Callus EVs）；评估这些EVs对人类皮肤成纤维细胞和角质形成细胞的伤口愈合及抗炎活性；鉴定EVs中富集的miRNA，并从中筛选出关键的功能性miRNA；最终，探究该植物miRNA是否能够模拟EVs的生物学效应，从而揭示一种基于植物EV-miRNA的跨物种调控新机制。
研究的具体工作流程包含五个主要环节，环环相扣，系统而严谨。第一环节是山茶花愈伤组织的诱导培养与细胞外囊泡的分离纯化。研究人员首先对山茶花叶片进行表面灭菌，切块后置于含有2,4-D（一种生长素）的MS固体培养基上，在黑暗条件下诱导愈伤组织形成。经过数周培养和数次继代，获得了均质、亮黄色、生长迅速的愈伤组织细胞系。随后，将愈伤组织转移至液体培养基中进行悬浮培养，并进一步放大至生物反应器中进行大规模扩增。培养4周后，收集条件培养基，通过系列离心（包括3000-4000× g去除碎片，以及100,000-150,000× g超速离心）来分离和沉淀EVs。纯化后的EVs重悬于去离子水中，通过0.22 μm滤膜除菌并储存于-80°C备用。本环节使用了纳米颗粒追踪分析技术（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）来测定EVs的粒径分布（平均155.8 nm）、颗粒浓度（1.3 × 10¹⁰ particles/ml）和Zeta电位（-35.34 mV）。同时，利用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察了EVs的典型杯状球形形态，并通过蛋白质印迹法检测到了植物EV的标志性蛋白TET8和PEN1，从而从物理特性和生物标志物两个层面确认了所分离囊泡的身份和纯度。
第二环节是评估CJ-Callus EVs对人类皮肤细胞的生物学效应。研究使用了两种细胞模型：人皮肤成纤维细胞和人永生化角质形成细胞。首先进行细胞活力实验，确认所用浓度的EVs对细胞无毒性。接着，通过荧光标记（LipidyeII）EVs并与人角质形成细胞共孵育，在荧光显微镜下直观观察到了EVs被细胞摄取进入胞质的过程，这为后续的跨物种调控提供了直接证据。核心功能实验分为两部分。在伤口愈合方面，使用划痕实验模型，将人成纤维细胞接种于特制的伤口愈合插件中，移除插件形成标准划痕后，用不同浓度的CJ-Callus EVs处理细胞48小时。显微镜观察和Image J软件分析显示，EVs处理以剂量依赖的方式显著加速了伤口闭合，在1.0 × 10⁹ particles/ml浓度下，伤口闭合率达到46.0%。此外，为了模拟皮肤损伤环境，研究用UVA照射成纤维细胞造成光损伤，然后检测EVs对细胞外基质相关基因表达的影响。定量逆转录聚合酶链反应结果显示，EVs处理显著上调了I型胶原蛋白基因（COL1A1和COL1A2）的表达（分别提高4.31倍和3.24倍），同时显著下调了基质金属蛋白酶1的基因表达。免疫细胞化学染色进一步证实，EVs处理能恢复UVA照射导致的I型胶原蛋白表达下降。在抗炎活性方面，研究使用肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ刺激人角质形成细胞以诱导炎症状态，然后给予CJ-Callus EVs处理。结果表明，EVs处理能显著降低炎症细胞中白细胞介素-6的基因表达和蛋白质分泌水平，展现了其抗炎潜力。
第三环节是鉴定EVs中富集的关键miRNA。研究人员从CJ-Callus及其来源的EVs中分别提取了小RNA，并进行了高通量小RNA测序。通过对测序数据的生物信息学分析（使用FastQC进行质控，Cutadapt去除接头，Bowtie比对，MIRKwood和Brumir进行miRNA预测，并与miRBase数据库比对验证），他们发现，与愈伤组织本体相比，EVs中选择性地富集了多种miRNA，其中miR408的丰度最高。这一发现提示，miR408可能是EVs发挥功能的关键活性成分之一。
第四环节是验证miR408的生物学功能。为了探究EVs的活性是否由其富含的miR408所介导，研究人员合成了miR408模拟物（mimic），并直接转染到人皮肤细胞中，重复了第二环节中的关键功能实验。结果令人瞩目：转染miR408能显著促进成纤维细胞的伤口闭合（效率达46.19%）；在UVA损伤模型中，miR408对COL1A1和COL1A2的上调作用甚至强于完整的EVs处理（分别提高9.17倍和6.38倍），并能几乎完全抑制MMP1的表达。同时，在炎症角质形成细胞中，miR408模拟物也能显著降低IL-6的基因和蛋白水平，抗炎效果与EVs相当。这些平行实验结果表明，从山茶花愈伤组织EVs中鉴定出的miR408，其本身就能在很大程度上重现EVs的伤口愈合和抗炎活性。
第五环节是数据分析与整合。本研究中的所有定量实验（细胞活力、划痕愈合率、qRT-PCR、ELISA）均至少独立重复三次，数据以均值±标准差表示。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及随后的t检验，以p值小于0.05作为显著性判断标准。图像数据（如荧光显微镜、TEM图像）则提供直观证据。最终，将EVs的表征数据、功能实验数据以及miRNA测序与功能验证数据相互关联、印证，构建了完整的证据链。
本研究取得了一系列明确而重要的结果。首先，成功建立了一套从山茶花愈伤组织规模化培养到高纯度EVs分离鉴定的完整技术流程，并证实了所获CJ-Callus EVs具备典型的植物EV特征。其次，功能实验数据确凿地证明，CJ-Callus EVs能有效促进人皮肤成纤维细胞的迁移和伤口闭合，上调胶原合成、抑制其降解，并能抑制角质形成细胞的炎症反应。这些结果直接支持了“CJ-Callus EVs具有促进皮肤修复和抗炎的潜力”这一论点。接着，小RNA测序这一关键步骤发现了miR408在EVs中的特异性富集，这为从分子层面解释EVs的功能提供了线索。最后，也是本研究的点睛之笔，通过功能获得性实验，直接证明外源性添加miR408模拟物能在人皮肤细胞中产生与完整EVs相似甚至更强的促修复和抗炎表型。这一系列结果从“现象观察”到“组分鉴定”，再到“因果验证”，逻辑严密地推导出核心结论：山茶花愈伤组织来源的细胞外囊泡通过富含miR408，能够介导一种跨物种的基因调控，从而促进人类皮肤细胞的伤口愈合并抑制炎症。这首次将植物miR408的功能与人类皮肤健康直接联系起来。
本研究的结论是：来自山茶花愈伤组织的细胞外囊泡及其富含的miR408，在体外模型中展现出显著的促进皮肤伤口愈合和抗炎的双重生物活性。这一发现不仅为山茶花的应用开发提供了全新的视角（从传统提取物扩展到纳米囊泡和miRNA），更重要的是，它揭示并证实了植物源miRNA（特别是miR408）能够跨越物种界限，调控人类皮肤细胞基因表达和生理功能的可行性与有效性。这项研究具有重要的科学价值与应用价值。在科学上，它加深了我们对植物-哺乳动物跨物种通讯机制的理解，为“食品/植物源性miRNA作为信号分子”这一新兴领域增添了有力证据，并拓展了细胞外囊泡作为天然药物递送系统的认知。在应用上，该研究为开发基于植物EVs或特定植物miRNA（如miR408）的新型、高效、安全的皮肤修复制剂、抗衰老化妆品乃至治疗慢性伤口或炎症性皮肤病的生物疗法奠定了坚实的实验基础，指明了新的研发方向。
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：第一，研究选题新颖，巧妙地将植物生物技术、细胞外囊泡科学、miRNA生物学和皮肤医学交叉融合，探索了前沿的跨物种调控议题。第二，技术路线完整且严谨，从植物材料制备、EVs分离表征、细胞功能评估到miRNA组学分析与功能验证，形成了一个闭环式的研究体系，证据链坚实。第三，核心发现具有突破性，首次系统报道了山茶花EVs的皮肤修复功能，并首次将植物miR408的功能明确指向人类皮肤的伤口愈合与抗炎过程，提出了一个全新的活性成分和作用机制。第四，应用潜力巨大，研究结果为开发下一代“绿色”纳米生物制剂和基因调控型护肤品提供了具体的候选分子和理论依据。
此外，研究中提及通过生物反应器进行EVs的规模化培养，展示了未来工业化生产的可行性；对植物EV标志蛋白的检测也增强了研究在植物EV领域的规范性和可比性。尽管作者在讨论中也指出，miR408的具体下游靶基因及其精确调控通路尚待进一步阐明，但这并不影响本研究核心结论的成立，反而为后续的机制深入探索指明了方向。这项研究是一项兼具创新性、系统性和应用前景的优秀工作，为相关领域的研究者和产业界提供了重要的参考和启示。