本研究由广州中医药大学第一附属医院肾病科的Yu Yanna、Li Min、Lai Weijie、Dong Xin、Zhang Shu、Zhang Liangyou及Chen Gangyi等人完成，发表于 Journal of Pharmacy and Pharmacology 2024年第76卷，文章于2024年7月13日在线发表。研究团队来自广州中医药大学及广东省中医药临床研究院，第一作者为Yu Yanna，通讯作者为Chen Gangyi。
糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病最严重的血管并发症之一，也是全球终末期肾病的主要病因。目前DN的治疗选择有限，给患者健康及社会医疗体系均带来沉重负担。DN的发病机制复杂，涉及代谢紊乱、氧化应激、晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products, AGEs）形成、免疫反应及线粒体损伤等多个方面。近年来，Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1）/核因子红细胞2相关因子2（nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2, Nrf2）/抗氧化反应元件（antioxidant response element, ARE）信号通路被认为是细胞应对氧化应激和外源性毒性损伤的重要防御机制。在生理条件下，Keap1通过CUL3-RBX E3泛素连接酶复合物促进Nrf2降解；氧化应激状态下，Nrf2逃脱降解并进入细胞核，激活ARE下游多种抗氧化及细胞保护基因的转录，如血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶重亚基（γ-glutamylcysteine synthetase heavy subunit, γ-GCS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、醌氧化还原酶1（quinone oxidoreductase-1, NQO1）和谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase, GST）。已有研究表明，上调Nrf2对DN动物模型具有保护作用，激活Nrf2/ARE通路已成为DN治疗的重要策略之一。
升清降浊胶囊（Shengqing Jiangzhuo Capsule, SQJZJN）是20世纪80年代由广东名医洪钦国教授研制的治疗慢性肾衰竭和DN的中药复方。该方由虎杖、土茯苓、槐花、黄芪等多种中药组成，具有健脾益气、升阳固本、降浊解毒、活血化瘀的功效。然而，SQJZJN对DN的保护作用机制尚未被系统阐明。本研究旨在利用db/db小鼠和高糖培养的人肾小球系膜细胞（human glomerular mesangial cells, HMCs）模型，探讨SQJZJN是否通过激活Keap1/Nrf2/ARE信号通路而发挥肾脏保护作用，并抑制凋亡信号。
在研究方法方面，本研究首先对SQJZJN样品进行了超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS）分析。样品经研磨、溶解、过滤后，使用Dionex Ultimate 3000 UHPLC系统配备ACQUITY UPLC® HSS T3色谱柱进行分离，流动相由0.1%甲酸水和乙腈组成，采用梯度洗脱。质谱检测使用Q Exactive Orbitrap质谱仪，在正负离子模式下采集数据，最终从SQJZJN中检测并初步鉴定出69种化合物。
在体内实验中，选用8周龄雄性db/db小鼠作为2型糖尿病模型，db/m小鼠作为对照。动物分为五组：db/m对照组、db/m+SQJZJN组、db/db模型组、db/db+SQJZJN组和db/db+缬沙坦（valsartan）组，每组5只。SQJZJN按900 mg/kg/天灌胃给药，缬沙坦按12 mg/kg/天给药，持续8周。实验期间每4周检测尾静脉血糖和血清肌酐，第8周收集24小时尿液检测尿素和尿微量白蛋白，并计算尿白蛋白/肌酐比值（albumin/creatinine ratio, ACR）。实验结束后取肾组织用于HE、PAS和Masson染色、免疫组化、免疫荧光、透射电镜观察以及RT-qPCR和Western blot检测。同时，采用试剂盒检测肾组织中AGEs和活性氧（reactive oxygen species, ROS）的水平。
细胞实验使用HMCs作为研究对象。通过给SD大鼠灌胃SQJZJN制备含药血清，HMCs在30 mmol/L高糖DMEM培养基中培养以建立DN细胞模型。实验分为正常对照组（5.6 mmol/L葡萄糖）、高糖组（30 mmol/L葡萄糖）以及三个SQJZJN含药血清组（5%、10%、15%浓度）。处理48小时后，采用免疫组化和Western blot检测Keap1/Nrf2/ARE通路相关蛋白的表达变化。
研究结果显示，在体内实验中，与db/m小鼠相比，db/db小鼠体重和血糖显著升高，而SQJZJN治疗后体重和血糖部分下降。血脂方面，SQJZJN和缬沙坦均能降低db/db小鼠血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平，同时升高高密度脂蛋白胆固醇水平。肾功能方面，SQJZJN显著降低了db/db小鼠血清肌酐、尿微量白蛋白、AGEs和ROS水平，但对尿素和ACR未见显著影响。组织学检查显示，db/db小鼠出现肾小球体积增大、系膜扩张、肾小管扩张、空泡变性和上皮细胞脱落等典型糖尿病肾病病理改变，SQJZJN治疗可明显改善这些病变。TUNEL检测显示SQJZJN可减少肾细胞凋亡，透射电镜观察发现SQJZJN改善了线粒体脊断裂等超微结构损伤。
在机制研究方面，RT-qPCR结果表明，db/db小鼠肾组织中Nrf2、γ-GCS、SOD1、HO-1、NQO1和GST的mRNA表达均下调，而Keap1表达上调；SQJZJN干预后上述基因表达趋势发生逆转。免疫组化检测显示，SQJZJN可恢复db/db小鼠肾小管区域内降低的Nrf2和HO-1蛋白水平。Western blot进一步证实了这些蛋白表达水平的一致性变化。在体外实验中，免疫组化结果显示，与高糖组相比，正常对照组、10% SQJZJN组和15% SQJZJN组中Nrf2和HO-1表达增加，Keap1表达下降，而5% SQJZJN组各指标无显著差异。Western blot同样证明各SQJZJN给药组中Nrf2、γ-GCS、SOD1、HO-1、NQO1和GST蛋白水平上调，Keap1蛋白水平下调。
综合以上结果，本研究的结论是：SQJZJN可通过激活Keap1/Nrf2/ARE信号通路，增强Nrf2核转位，上调HO-1、γ-GCS、SOD1等抗氧化蛋白表达，降低Keap1表达，从而减轻氧化应激和细胞凋亡，延缓糖尿病肾病的进展。该研究首次报道了SQJZJN通过调控Keap1/Nrf2/ARE通路保护DN的作用机制，为SQJZJN作为糖尿病肾病的潜在中药治疗药物提供了实验依据。
本研究的亮点包括：首次系统阐明了SQJZJN防治DN的分子机制；采用db/db小鼠和高糖诱导HMCs的体内外联合模型，从整体、组织、细胞和分子多层次验证药物效果；发现SQJZJN不仅能改善肾功能和肾脏组织病变，还能降低AGEs和ROS水平并减少细胞凋亡；通过UHPLC-MS鉴定了SQJZJN中的69种化合物，为后续药效物质基础研究提供了数据支持。该研究体现了传统中药复方在现代医学研究框架下进行机制探索的可行路径，对中药治疗慢性肾脏疾病的研究具有借鉴意义。此外，研究还提示，不同浓度的含药血清对通路蛋白的影响存在剂量依赖性趋势，10%和15%浓度效果显著优于5%浓度，这为临床合理用药提供了参考。